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第一章绪论1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。2生物技术的主要内容：P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题第二章基因工程制药1、简述基因工程制药的基本程序。P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDNA的分离和鉴定）①核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白，②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测）4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难；②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体,inclusionbody)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂；③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制；④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应；⑤细菌的内毒素不容易清除；⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化；5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。②载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到；③外源基因产物不形成包含体，分离与纯化工艺可以大大被简化；④可以直接食用，等于直接口服药物6、结合pBG-2说明选择用于E.coli细胞宿主中的载体的6项原则。P23与pBV220优点类似，原则P227、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标？P32如何计算质粒的稳定性？P33质粒稳定性分析方法（ST=出现的菌落数/100）8、简述提高质粒稳定性的两步培养法P33分阶段控制培养普遍使用的两步培养法，是在接种后只让菌体细胞快速分裂，这一步培养过程中，外源基因不表达；然后再诱导载体上的药物基因以最高效率表达，积累药物蛋白。9、简述基因工程药物分离纯化工艺设计中必须考虑的药物的5个特点。P46（↓摘自PPT）⑴在初始物料中的含量低：药物分离困难。外源基因表达尽管是在菌体生长对数期被诱导的，在与菌体生长过程中的代谢产物比较，在发酵产物的初始物料中含量也是很低的。⑵初始物料的成分复杂：不利于药物蛋白的分离与纯化。除了药物基因产物外，菌体细胞、代谢产物、残留的培养基、无机盐，尤其是药物蛋白的类似物。⑶药物蛋白的稳定性差：分离与纯化条件相对苛刻。容易失活或变性，对各种物理化学因素十分敏感。⑷分离与纯化的技术差异大：基因工程药物种类繁多、结构复杂。不同的药物分离与纯化必须考虑其分子特征。⑸对不同药物的质量和纯度有不同的要求：药品质量标准是根据药物的应用制定的，没有统一的制备、分离、纯化的标准。第三章动物细胞工程制药1、解释动物细胞的两种培养方式。动物细胞培养大致可分为两种：群体培养(massculture)是把一定数量的细胞悬浮液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成单细胞层。克隆培养(clonalculture)是将高度稀释的游离细胞悬浮液置于培养瓶中，各个细胞贴壁后彼此距离较远，经过生长增殖，每一个细胞集落均来源于一个细胞祖先，称为一个“克隆”(“clone”)。2、举例说明三种细胞培养特征。P801、贴壁细胞：生长须有贴附的支持物表面；贴附因子来自培养基或细胞自身分泌。有两种细胞类型：成纤维细胞型、上皮细胞型。2、悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞。3、兼性贴壁细胞：生长对贴壁支持物表面要求不严格。如中国地鼠卵巢细胞（CHO），小鼠L929细胞。3、细胞系与细胞株的区别是什么？细胞系(cellline)：从原代培养经传代培养后得到的一群不均一的细胞，可以连续培养，即这些细胞具备培养条件下的无限增殖能力。细胞株(cellstrain)：通过选择或克隆化，从原代培养的细胞群获得的、具有特殊遗传/生化性质或特异性标记的细胞群。细胞株强调培养的细胞的单一性特征，即克隆本质；而细胞系并不强调细胞的纯度，可以包含多种细胞，但主类细胞占大多数。4、说明动物细胞培养生产药物的优缺点。缺点：培养条件苛刻、成本高、产量低。优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。5、如何获得二倍体细胞株？PF86何为二倍体细胞株①从动物胚胎组织中获得②从各国细胞库或有关机构获取（P87第二段）6、举例说明两类基因工程细胞。A.病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆状病毒B.质粒载体：穿梭质粒载体7、简单但全面叙述杆状病毒－昆虫细胞表达系统。（需总结概括）杆状病毒(Baculoviruses)是昆虫病毒，128kb双链DNA基因组。优点P88杆状病毒基因组比较大，一般用同源重组方法引入外源基因。构建过程：①插入位点：多角体蛋白基因启动子的后面；②操作方式：重组质粒与杆状病毒共同转染昆虫细胞，获得发生同源性重组的、含有外源基因的病毒颗粒；③导入细胞：重组病毒载体感染昆虫细胞(如Sf-9细胞株)(如果用的是BmNPV，可以直接感染家蚕，获得转基因动物。)8、构建基因工程细胞选择质粒载体所考虑的4个问题。P88最后一段9、说明动物血清在细胞培养中的作用。①提供生长因子和激素②提供贴壁因子和伸展因子③提供结合蛋白④提供必需脂肪酸和微量元素10、细胞大量培养为什么必须使用无血清培养基？⑴提高细胞培养的可重复性，避免血清差异的影响；⑵减少血清带来的污染；⑶供应及时、稳定、充足；⑷细胞产品容易纯化；⑸避免血清某些成分对细胞的毒性；⑹减少血清蛋白对生物测定的干扰。第四章抗体制药1、画图说明抗体分子（IgG）的结构，指出Fab、Fv、Fc和Fd。P1512、说明单克隆抗体在医疗和研究中的三个用途。详见P143单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。如1.利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。2.用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。3.单克隆抗体制剂也用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，因其对器官移植排斥反应有显著的抑制效果，用作免疫抑制剂已在美国标准上市。3、获得单克隆抗体为什么必须使用杂交瘤技术？度娘杂交瘤技术杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。4、什么是HAT选择？P146最后一段5、说明检测杂交瘤的细胞学方法的原理。P148动物的染色体制片技术相对简单，在普通光学显微镜下就可以确定染色体核型(chromosomekaryotype)。小鼠的染色体全部都是端部着丝点染色体，2n=40；骨髓瘤细胞染色体数目大于40，2n＞40，并且有骨髓瘤特有的标记染色体。所以，杂交瘤细胞的染色体数目应该是两种细胞染色体数之和。由于有HAT选择在前，用核型分析确定杂交瘤细胞只有一个条件：2n≥80。6、说明对鼠原性单克隆抗体改造的两个原则。降低免疫原性、降低分子量。7、说明CD4-Ig抗HIV的原理。HIV感染就是其gp120专一性结合淋巴T细胞巨噬细胞表面的细胞受体CD4(CD4是T细胞重要的活化因子)，使T细胞和巨噬细胞失去对HIV和其它病原体的免疫攻击能力。CD4-IgG是把分化抗原CD4结合到IgG的FC区，称免疫黏连素。HIV表面的gp120只有一个与CD4结合的位点，只要免疫黏连素CD4-IgG分子与gp120结合，HIV就失去了感染能力。10、说明细胞因子IL-1和IL-2的免疫学功能。爱咋咋地11、为什么噬菌体表面展示和PCR技术是抗体库构建的两项分子生物学技术基础。噬菌体表面展示技术(phagedisplay)被广泛应用于抗体库构建，成为目前使用的噬菌体抗体库技术(phageantibodylibrary)。噬菌体表面展示，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体，并且将抗体基因克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，在数日内即可筛出阳性克隆，从而能构建出大库容（108）文库囊括天然全套抗体基因，使抗体工程的设想成为现实。第五章植物细胞制药1、解释：初级代谢产物、次生代谢产物、外植体P1782、说明培养基中的碳、氮、无机盐和生长因素。P1863、说明植物细胞培养基中的碳源来源及其作用。P1954、说明常用的植物生长素与细胞分裂素。P1895、培养基中生长素与细胞分裂素的配比的效应。生长素/细胞分裂素:高,有利于根和愈伤组织的形成.适中,有利于根芽的分化.低,有利于芽的形成6、举例说明诱导子在培养中的作用。P2047、举例说明什么是前体饲养？P206第七章发酵工程制药1、现代生物技术改造传统制药工业体现在哪四个方面？（1）抗生素生产：分离抗生素合成酶基因，提高产量、得到杂合抗生素；（2）氨基酸生产：基因克隆的工程菌、细胞融合育种；（3）维生素生产：构建制造维生素C的基因工程菌；（4）疫苗生产：把抗原克隆到E.coli中大量生产疫苗。2、抗生素生物合成基因群成员的三个结构特点。P2833、简要说明提高抗生素的产量的四项措施。P2944、为什么增加抗性基因的拷贝数可以提高工程菌的抗生素产量P294