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生工测序生工SangonBiotech生工SangonBiotech内容•1.生工测序•2.生工测序特点、原理和流程•3.一代测序常见问题分析及处理生工SangonBiotech生工测序•1.生工测序部成立于2000年，是国内商业常规测序行业领导者之一•2.强大的测序能力：生工测序拥有二十台ABI3730xl测序仪，最大能力可每天可接受近20000多个反应的国内规模领先的常规测序能力•3.稳定的测序质量：生工拥有近二十年的常规测序行业经验的团队，拥有一批测序经验十分丰富并且稳定的测序实验技术人员，从而保证生工有稳定高效的测序质量生工SangonBiotechDNA测序基本原理及流程•Sanger法:即双脱氧终止法•原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4中dNTP存在的条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例加入4中双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为双脱氧核苷没有3’-OH，所以双脱氧核苷参入到链的末端，链的延长停止，若是参入单脱氧核苷链继续延长。生工SangonBiotech核酸序列形成的基础生工SangonBiotech双脱氧末端终止生工SangonBiotech终止物标记生工SangonBiotechSanger测序——末端终止标记生工SangonBiotechddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH被氧化，下一个dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止生工SangonBiotech测序分类•一、基本测序：•二、克隆测序•三、Cosmid/Fosmid/BAC末端测序生工SangonBiotech一、基本测序样品类型及要求•1、菌液：200ul以上•2、PCR未纯化：25ul,3ul检测有清晰的目的条带•3、PCR以纯化：20ul,3ul电泳检测条带单一•4、质粒：20ul,浓度100ng生工SangonBiotech样品处理•1、菌液：质粒提取过夜培养鉴定反应上机测序序列分析结果报告生工SangonBiotech样品处理•2、PCR未纯化：纯化鉴定反应上机测序序列分析结果报告生工SangonBiotech样品处理•3、PCR以纯化：鉴定反应上机测序序列分析结果报告生工SangonBiotech样品处理•4、质粒：鉴定反应上机测序序列分析结果报告生工SangonBiotech测序常见问题•1、重叠峰•2、无信号生工SangonBiotech重叠峰常见原因原因1、引物2、模板特异性降解非单一模板有特殊结构换引物质粒/菌：重新挑克隆PCR产物：克隆高GCPoly结构发卡结构回文结构重复序列生工SangonBiotech无信号常见原因原因1、引物2、模板无结合位点浓度过低浓度过低换引物重新送样生工SangonBiotech菌/质粒测序成功峰图生工SangonBiotechPCR测序成功生工SangonBiotech问题峰图-质粒无信号生工SangonBiotechPCR双峰（结构）生工SangonBiotechPoly结构生工SangonBiotech二、克隆测序•克隆测序：即将要测序的片段插入到克隆载体中，获取含有待测片段的质粒，然后进行测序。•TA克隆：利用Taq聚合酶具有末端转移酶活性，可在PCR产物的3’端加上一个非模板依赖碱基A，然后与T载体连接的技术。生工SangonBiotechTA克隆生工SangonBiotech筛选方法•蓝白斑筛选：一种基因工程常用的重组菌筛选方法。•原理：野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。生工SangonBiotechα-互补•β-半乳糖苷酶缺陷型菌株：β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段-个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。•蓝白斑筛选的载体：具有一段lacz’的基因，包括一段β半乳糖苷酶的启动子、编码α肽链的区段、一个多克隆位点（MCS）。生工SangonBiotechα-互补•即：携带lacz’基因的质粒编码的α肽链和宿主编码的N端有缺陷的β半乳糖苷酶突变体互补，产生完整β半乳糖苷酶的能力——把X-gal分解成蓝色物质的能力。生工SangonBiotechTA克隆的优点•1、不需使用含限制酶序列的引物•2、不需要把PCR产物优化•3、不需要把PCR产物平末端处理•4、不需要把PCR产物加接头生工SangonBiotech克隆测序要求•1、PCR以纯化：浓度≥20ng/ul，体积20ul•2、PCR未纯化：浓度≥50ng/ul，体积25ul•3、务必订单上注明PCR所用引物序列，以便用于克隆结果的核对分析•4、克隆片段信息：名称、大小、样品是否带A尾以及PCR产物类型生工SangonBiotech最终交付•1、测序原始图谱和序列•2、去载体后的序列•3、要求测通的样品则提供拼接序列•4、可以提供高质量的质粒生工SangonBiotech基本流程模板制备PCR扩增纯化回收P已载体制备（如：pUCm-T载体）连接感受态制备转化蓝白斑筛选挑取克隆、液体LB培养基培养酶切鉴定测序结果生工SangonBiotech克隆测序所用到的试剂X-gal、ITPG、T4DNA连接酶、LB培养基（胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl）、琼脂粉、抗生素等。生工产品广告来了生工SangonBiotech三、Cosmid/Fosmid/BCA末端测序•末端测序技术通过测定插入片段两端的序列，能够迅速而精确地进行序列拼装，并确定基因组序列结构的多态性，如倒置和易位等，在基因组全序列测序中有着举足轻重的作用。生工SangonBiotechCosmid•Cosmid（黏粒）：指带有黏端位点(cos)的质粒。黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄青霉素抗性标记、cos位点。生工SangonBiotechCosmid特点•1、具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。•2、具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。•3、克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般只有5～7kb，而最大的克隆片段可达45kb左右。•4、能与有同源序列的质粒进行重组。生工SangonBiotechFosmid•Fosmid黏粒载体的一种，•Fosmid载体是当前流行的用于替代Cosmid载体构建大片段文库的新载体。•Fosmid文库的构建更简单，快速。生工SangonBiotechFosmid特点•1、由于插入了大肠杆菌致育因子F-因子，所以它在宿主菌中以单拷贝形式存在，稳定性好。•2、Fosmid载体上有一个可诱导的oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝。•3、随机性好，保证了每段DNA在文库中出现的频率均等生工SangonBiotechBAC即细菌人工染色体•BAC是一些环状的DNA分子。每个环状DNA分子携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子的严紧型控制的复制子，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶以及三个确保低拷贝质粒精确分配到子代细胞的基因座（parA、parB和parC）。生工SangonBiotechBAC载体克隆流程BAC载体线状及用磷酸酯酶处理对基因组DNA进行酶切，根据片段大小进行分离连接，通过电穿孔法转化大肠杆菌在添加CAM，IPTG和X-gal的琼脂糖平板上筛选转化株将筛选得到的转化子阵列排布进行杂交筛选或组成集合进行PCR筛选获取或构建BAC文库设计筛选实验，挑选目的克隆向核心机构提交杂交探针或PCR引物，进行筛选获得设计好的靶BAC克隆BAC克隆的培养和保存BACDNA的制备用PCR、Southern杂交或PFGE法分析DNA构建作图和（或）测序用的亚克隆文库克隆鉴定：PFGE分析克隆分析PCR法或Southern杂交进行验证生工SangonBiotechBAC文库应用•细菌人工染色体文库的构建是进行基因组研究的一项重要基础性工作，特别是对大基因组即超大基因组生物来说更是如此。•主要应用于物理作图、基因图位克隆、基因结构和调控研究。•BAC末端测序技术通过测定插入片段两端的序列，能够迅速而精确的进行序列拼装，并确定基因组序列结构的多态性，如倒置和异位等。生工SangonBiotech•BAC末端测序难点•一般来说，BAC测序比质粒或PCR产物的测序要困难得多。主要难点体现在以下几个方面：•1.BAC质粒插入片段长（一般大于100Kb），容易形成二级结构，而二级结构区域后的DNA链可能会因延伸不够充分而造成测序异常。•2.BAC测序需要高纯度的DNA，从而获得充足信号，以利于准确的碱基信号检出和最大读长的获得。但是BAC质粒在细菌中为单拷贝或低拷贝，DNA提取和纯化难度很大。•3.测序反应完成后，产物需进行纯化才能上机（ABI3730xl）检测。常规的纯化方法不能够完全去除残留的荧光染料，这会导致序列彩图中出现严重的干扰峰。生工SangonBiotech样本要求•1、甘油菌或穿刺菌：请注明其培养基、抗生素抗性、载体名称及是否需要诱导等信息；•2、质粒DNA：浓度需≥100ng/μl，总量≥1μg，OD值介于1.80～2.00之间，并确保DNA没有发生降解。生工SangonBiotech流程BAC克隆DNA提取测序序列分析发送结果及报告生工SangonBiotech最终交付•交付报告•测序报告：包括一份ab1格式的峰型彩图和一份seq格式的序列文件。生工SangonBiotech