测序知识概述

测序知识概述InvitrogenProprietary&Confidential2Content普通测序及测序相关基础知识普通测序生产流程介绍困难模板测序相关知识困难模板测序生产流程介绍测序简单问题解答InvitrogenProprietary&Confidential3普通测序及测序相关基础知识——基本概念什么是DNA以及DNA测序又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。DNA分子极为庞大(分子量一般至少在百万以上)，主要组成成分是腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸（简称A、T、C、G）。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。InvitrogenProprietary&Confidential4普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA的结构DNA共有四级结构一级结构：由多个4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特定构象。如超螺旋等。四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。——DNA测序就是测定DNA的一级结构InvitrogenProprietary&Confidential5普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。InvitrogenProprietary&Confidential6普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。。InvitrogenProprietary&Confidential7普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA结构示意图——DNA的四级结构：DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。InvitrogenProprietary&Confidential8普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA测序原理目前DNA测序的原理是Sanger双脱氧链末端终止法，简单来说，就是单引物扩增的PCR反应，但是将PCR反应体系中的dNTP换成了带有荧光标记的ddNTP和dNTP的混合物。目前最普遍的DNA测序技术是采用四色荧光分别标记四种ddNTP.一个样品的测序反应只需在同一反应体系中同时加入四种ddNTP.产物无须分离即可在一个泳道中电泳.序列的读取依靠检测器对不同荧光的区分.并需要通过软件系统的分析.动画演示：目前测序需要使用的仪器A.PCR扩增仪B.3730XL全自动荧光测序仪InvitrogenProprietary&Confidential9普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求测序分析软件A.SequencingAnalysis5.2，用于将测序原始数据转换为峰图文件B.DNAStar,用于将测序得到的结果进行拼接C.Chromas，用于显示DNA测序峰图文件测序模板的要求PCR产物直接测序PCR已纯化产物：提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul(浓度大于50ng/μl),并请提供浓度(浓度须正确)大于3.2pmol/μl的测序引物10～20μl（具体体积视客户反应数相应增加）。未纯化PCR产物：提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带,同时请提供浓度(浓度须正确)大于3.2pmol/μl的测序引物10～20μl（具体体积视客户反应数相应增加）。InvitrogenProprietary&Confidential10普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求注意事项:PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡用胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开时，此时的PCR产物直接测序会出现双峰，这种情况建议把PCR产物克隆后测序。PCR已纯化产物请用水稀释不要用elutionbuffer。PCR产物直接测序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反应的引物便一定能测序。测序用引物要求较高,引物的3‘端必须与模板完全配对，含有Mix碱基的引物一般不能测序(特别是3’端)。此外，测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50～60%左右，TM值在55-65度之间。尽量保证测序引物的纯度。并且引物需要用水而非TE溶解。PCR未纯化产物最好不要添加染料。InvitrogenProprietary&Confidential11普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求质粒DNA的测序质粒样品：请注明载体名称及是否含有特殊结构、插入片段的长度及插入片段的酶切位点情况、请提供至少15ul以上的提纯的质粒DNA，浓度大于200ng/μl（体积视客户反应个数适当增加）。含有质粒的菌液/沉淀菌体/平板菌/穿刺菌样品：请注明菌体的种类及抗生素抗性的情况、所含载体的名称及结构情况、插入片段的长度及插入片段的酶切位点情况、如果有特殊抗生素添加比例或培养条件特殊须注明。含有噬菌体DNA的样品公司均不提供此类抽提服务，请客户提供质粒形态的样品20ul，浓度大于50ng/μl。务必需要客户注明是含有噬菌体DNA的质粒。InvitrogenProprietary&Confidential12普通测序及测序相关基础知识——测序引物的要求长度在18-25bp之间GC含量在35%-60%之间不含兼并碱基TM值在55-65度之间无引物二聚体、无发夹结构随机引物和带有荧光标记的引物不能测序如果设计引物，最好引物距离目的基因50bp左右InvitrogenProprietary&Confidential13普通测序生产流程介绍客户样品送达公司后，需要3个阶段A.模板制备阶段B.测序反应阶段C.报告分析阶段InvitrogenProprietary&Confidential14困难模板测序相关知识——困难样品的定义和鉴别困难样品的定义和鉴别不满足常规测序样品质量要求的样品用常规测序反应体系无法得到正常结果的样品分类现象样品类型样品鉴别序列结构困难模板中断/衰减POLYG/C质粒：≥10个连续单碱基重复PCR产物：≥5个连续单碱基重复POLYA/T质粒：≥15个连续单碱基重复PCR产物：≥10个连续单碱基重复二级结构/发夹结构用于RNAi干扰实验GCRICH局部75％GC碱基富集ATRICH局部80％AT碱基富集样品片段大于10KB测序序列有峰值，但背景信号极高，导致机器无法判读，用通用测序反应体系（5ul体系）无法得到结果InvitrogenProprietary&Confidential15困难模板测序相关知识——困难样品的定义和鉴别优化模板质量双峰非单克隆（质粒）外源插入片段中双峰模板不纯/多条带PCR样品中含1－100BP差异的多个片段，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离无信号引物模板不匹配1、无结合位点无信号2、测序引物与模板Tm值相差太大，无法结合无信号模板浓度低用通用测序反应体系（5ul）无法得到结果,，预试验中电泳鉴定模板条带亮度低于标准50ng/ul的marker杂峰引物特异性差测序序列有峰值，但背景信号极高，导致机器无法判读，用通用测序反应体系（5ul体系）无法得到结果预试验失败菌不长二次摇菌培养，菌液仍清淡不足以抽提质粒抽不出质粒两次抽提质粒电泳鉴定无质粒条带或条带亮度很弱，不足以进行反应多条带在琼脂糖胶上看到多条扩增产物带，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离质粒含基因组DNA在琼脂糖胶上，质粒主带后看到基因组DNA带InvitrogenProprietary&Confidential16困难模板测序相关知识——常规样品与困难样品的不同点正常样品困难样品预实验部分1、菌液样品颜色略微偏白，培养过夜后，摇荡新鲜培养液呈漂絮状2、质粒2ul电泳鉴定无杂带，主条带亮度达100ng/ul（与标准质粒带对比）3、PCR产物2ul电泳鉴定无杂带或无弥散状，主条带亮度达50ng/ul（与标准Marker对比）1、菌液样品清澈，二次摇菌培养，菌液仍清淡如培养前，不足以抽提质粒2、菌液颜色泛黄，呈泥水状，两次抽提质粒电泳鉴定无质粒条带或条带亮度很弱，不足以进行测序反应3、PCR产物在琼脂糖胶上看到多条扩增产物带，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离4、PCR产物电泳鉴定时，在琼脂糖胶上2ul的上样量看不到扩增产物带5、质粒样品已降解：电泳鉴定在琼脂糖胶上看到火箭状拖尾6、质粒样品含RNA带：在琼脂糖胶上，质粒主带前看到较宽的RNA带7、质粒含基因组DNA：在琼脂糖胶上，质粒主带后靠近点样孔，看到基因组DNA带InvitrogenProprietary&Confidential17困难模板测序相关知识——常规样品与困难样品的不同点正常样品困难样品测序反应后1、菌液、质粒样品测序反应后，测序结果的彩图是清晰的，背景信号干扰少，峰型是尖的，尖峰与读取的碱基编码是一致的，中间波形紧凑均匀的，正常的测序反应能保证达到800Bases以上，见例图2、PCR样品正常测序结果峰值判断与质粒样品大致相同，唯一区别是PCR产物测序结束的末端最后一个碱基为A（绿色峰），见例图1、测序信号未能延伸到800BP之后，出现信号中止或衰竭2、测序信号为单个峰上再叠一个峰，称为双峰3、测序信号只有背景信号，无清晰峰值，称为无信号4、测序图谱有样品峰存在，但背景信号掩盖了部分样品峰值信号，称为杂峰InvitrogenProprietary&Confidential18测序简单问题解答——术语讲解摇菌摇菌是指将客户提供的菌液、穿刺菌、平板菌接入液体培养基中，37℃过夜培养，从而得到足够用于抽提出一定浓度质粒的过程。划平板平板是将用于细菌培养的固体培养基，倒于平皿之上，待凝固后用于培养细菌。划平板是用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离、克隆的活化。（如图）通知客户“划板失败”，是即使我们通过将客户的菌液通过划平板处理，但是平板上没有菌落生长，证明克隆可能已经没有活力，建议客户重新提供样品。InvitrogenProprietary&Confidential19测序简单问题解答——术语讲解抽质粒质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子抽质粒是指用质粒抽提试剂盒，采用碱裂解法，经过裂解去除蛋白等步骤，从细菌中获得质粒DNA的过程。鉴定鉴定是指将抽提出的质粒、客户提供的质粒&PCR已纯化产物、PCR未纯化产物取2ul经EB染色，点于1.3%琼脂糖凝胶上，通过观察DNA样品条带亮度对样品浓度进行判定的过程。InvitrogenProprietary&Confidential20测序简单问题解答——术语讲解条带条带是DNA样品（质粒、PCR产物）经过EB染色，在琼脂糖胶上形成的明亮带，条带的存在证明客户的样品中存在一定量的DNA模板(如图)。通常，我们通知客户“无条带”的意思是：客户的样品我们经EB染色，在琼脂糖胶上没有亮带，证明客户提供的样品中，没有DNA模板，或模板含量极低，不能用于测序。条带弱的意思是与DNAMarker相比，条带亮度弱，无法从胶中回收产物。InvitrogenProprietary&Confidential21测序简单问题解答——术语讲