农业部953号公告-5-2007

GGB中华人民共和国国家标准农业部953号公告-5-2007转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法DetectionofgeneticallymodifiedanimalsandderivedproductsQualitativePCRmethodforgrowthpromotingScGHtransgeniccommoncarp2007-12-18发布2008-03-01实施中华人民共和国农业部发布ICS备案号：农业部953号公告－5－2007II前言本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。本标准主要起草人：梁利群、历建萌、孙效文、沈平、闫学春、常玉梅。本标准为首次发布。农业部953号公告－5－20071转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法1范围本标准规定了转ScGH基因促生长鲤鱼基因特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转ScGH基因促生长鲤鱼中转基因成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用引用文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求GB/T18654.2-2养殖鱼类抽样检测第2部分：抽样方法SC/T3016-4水产品抽样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1cytb基因cytbgene编码鲤鱼细胞色素b的基因。3.2ScGH基因ScGHgene大麻哈鱼生长激素基因。4原理针对转ScGH基因促生长鲤鱼含有的ScGH基因序列，设计基因特异性引物进行PCR扩增，以检测试样中是否含有ScGH基因。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。对实验室的要求按NY/T672执行。5.1TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反应缓冲液（含25mmol/LMg2+）。5.2DNA分子量标准：能够区分50bp～1000bp的DNA片段。5.3dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.4氯仿:异戊醇（24:1,v/v）。农业部953号公告－5－200725.5酚:氯仿:异戊醇（25:24:1,v/v）。5.6琼脂糖。5.710g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.810mol/L氢氧化钠溶液：称取80.0g氢氧化钠（NaOH），加入160mL水中完全溶解，加水定容至200mL。5.9500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（5.8），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.8）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.101mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1L。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.111mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH7.5）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至7.5，加水定容至1L5.12TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.10）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.9），加水定容至1L。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.13TE缓冲液（pH7.5）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.11）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.9），加水定容至1L。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.145×TBE缓冲液：称取54gTris，27.5g硼酸，加500mL水搅拌溶解后，加入20mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.9)，然后用水定容到1L。5.15加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存。5.16DNA裂解液：0.5mol/LEDTA（pH8.0），200mg/L蛋白酶K(ProteinaseK)，0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)。5.17透析液：50mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.10），20mL500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（5.9），加水定容至1L。5.181mg/mL无DNA的RNA酶：将2mgRNA酶A溶于2mLTE(5.13)中，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。5.1970%乙醇溶液：取700mL无水乙醇，加水定容至1L。5.20引物5.20.1ScGH基因。GH-F：5ˊ—AGGATGAAACGGGTGGGT—3ˊ；GH-R：5ˊ—GGGTAGGAGGTCGCCAAAA—3ˊ；预期扩增片段152bp。农业部953号公告－5－200735.20.2cytb基因。L：5ˊ—GACTTGAAAAACCACCGTTG—3ˊ；H：5ˊ—CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC—3ˊ；预期扩增片段475bp。5.21引物溶液：用1×TE缓冲液（5.12）分别将上述引物稀释到25μmol/L。6仪器6.1PCR扩增仪。6.2电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.3凝胶成像系统或紫外透射仪。6.4重蒸馏水发生器或超纯水仪。6.5其他分子生物学实验室仪器设备。7操作步聚7.1抽样按GB/T18654.2-2和SC/T3016-4执行。7.2制样将待测样品(鱼肌肉、鳍条等组织)用消毒剪刀剪碎，颗粒大小在4mm以下进行DNA提取。7.3DNA模板制备7.3.1DNA模板的提取将剪碎样品30mg放入1.5mL离心管中，加入300μLDNA裂解液，50℃消化过夜，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇溶液，震荡混匀，室温2,500g离心5min，吸取上层水相，重复抽提二次。将上清液转入透析袋中进行数次透析，直到透析液OD2700.05，将透析袋中的液体转入离心管中，加入无DNA的RNA酶，终浓度为100mg/L，37℃温浴30min。先用冰预冷的无水乙醇沉淀，4℃，15,000g离心20min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，15,000g离心，2-3次，室温干燥后加TE(pH8.0)溶解，并保存于4℃备用。7.3.2DNA溶液纯度的测定和保存将DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外分光吸收率，以一个OD260值相当于50mg/LDNA浓度来计算纯化的DNA浓度。要求DNA溶液OD260/OD280的比值在1.7～1.8之间。依据测得的浓度将DNA溶液稀释至25mg/L～50mg/L，于-20℃保存。注：由于基因组DNA不宜反复冻融，建议多管分装保存，融化后应立即使用，剩余的DNA应在4℃冰箱中短期保存，存放时间不宜超过14d。7.4PCR反应7.4.1试样的PCR反应7.4.1.1每个试样PCR反应设置三次重复。7.4.1.2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50μL石蜡油（有热农业部953号公告－5－20074盖设备的PCR仪可以不加）。7.4.1.3将PCR管在台式离心机上离心10s后插入PCR仪中。7.4.1.4进行PCR反应。反应程序为：94℃变性3min；进行35次循环扩增反应（93℃变性30s，55℃（ScGH引物）或58℃（cytb引物）退火30s，72℃延伸40s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72℃延伸5min。7.4.1.5反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1PCR检测反应体系试剂体积无菌水18.3µL10×PCR缓冲液2.5µLdNTPs混合溶液1µL25µmol/L上游引物1µL25µmol/L下游引物1µL5单位/µLTaq酶0.2µL25mg/LDNA模板1.0µL总体积25µL鲤鱼内标准基因PCR检测反应体系中上、下游引物分别为L和H；ScGH基因PCR检测反应体系上、下游引物分别为GH-F和GH-R。7.4.2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与7.4.1相同。以非转基因鲤鱼DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以转ScGH基因促生长鲤鱼材料中提取的DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板；以无菌水代替空白对照PCR反应体系的模板。7.5PCR产物的电泳检测按15g/L的浓度称取琼脂糖加入0.5×TBE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，适当冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入0.5×TBE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7µLPCR产物与3µL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔中，其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源在2V～5V/cm条件下电泳。7.6凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照7.7和7.8执行。7.7PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7.8PCR产物的测序验证农业部953号公告－5－20075将回收的PCR产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述8.1对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，cytb内标准基因和ScGH基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出cytb基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。8.2试样检测结果分析和表述a）cytb内标准基因和ScGH基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出ScGH基因，表述为“试样中检测出ScGH基因，检测结果为阳性”。b）cytb内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而ScGH基因未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出ScGH基因，表述为“试样中未检测出ScGH基因，检测结果为阴性”。