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ICS67.120.30B52备案号：19162-2006北京市地方标准DBDB11/T371—2006鳄龟AmericanSnappingTurtle2006-07-25发布2006-10-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T371—2006I前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由北京市农业局提出并归口。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：杨华莲、张黎、潘志、宣庭孝、高南、赵睿。DB11/T371—20061鳄龟1范围本标准规定了鳄龟（ChelydraSerpentina）的主要生物学特性、肌肉营养成分分析、细胞遗传学特性、生化遗传学特性、分子遗传学特性，以及检测方法。本标准适用于鳄龟的种质鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T5009.3-2003食品中水分的测定GB/T5009.4-2003食品中灰分的测定GB/T5009.5-2003食品中蛋白质的测定GB/T5009.6-2003食品中脂肪的测定GB17718-1999鳙GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法GB/T18654.12-2002养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析3名称与分类3.1学名鳄龟（ChelydraSerpentina）3.2分类位置鳄龟科（Chelydridae）,鳄龟属（Schweigger），鳄龟（ChelydraSerpentina）。4主要生物学特性4.1外部形态特征4.1.1外形头伸出体外，不能缩入甲壳内，上下颌略尖，眼圆。尾长而尖，尾两侧有肉突，尾背前2/3处有一条鳞皮状隆起，呈锯齿状，皮呈褐色。被壳薄而坚，边缘有许多齿状突起，腹甲小，腹部淡黄色或浅褐色。前后爪较长，趾间具蹼，四肢较长且发达粗壮。背部由13枚-15枚背甲组成，有3条模糊棱。鳄龟正面图见图1，腹面图见图2。DB11/T371—20062图1鳄龟正面图图2鳄龟腹面图(1)吻(2)颈(3)前肢(4)背甲(1)吻(2)下颌(3)颈(4)前肢(5)背甲缘盾(5)后肢(6)爪(7)尾(6)后肢(7)爪(8)尾(9)腹甲4.1.2可数性状椎盾：5，颈盾：2，肋盾：8-10，缘盾：22，臀盾：2，喉盾：2，肱盾：2，胸盾：2，腹盾：2，股盾：2，甲桥：6，腋盾：2，侉盾：2，肛盾：1-2。4.1.3可量性状不同年龄组的鳄龟背甲、腹甲长和宽的实测值见表1。表1不同年龄组鳄龟背甲、腹甲长和宽的实测值（单位：cm）组别项目1龄2龄3龄4龄背甲长13.44±0.4916.90±0.3520.10±0.8522.70±0.56背甲宽11.56±0.6516.80±0.6721.60±0.8422.70±0.73腹甲长10.65±0.5212.10±0.5313.80±0.7216.00±0.58腹甲宽10.58±0.6315.00±0.6417.70±0.6520.80±0.744.2内部构造特征4.2.1脊柱骨颈椎8枚，胸椎10枚，荐椎2枚，尾椎20枚。4.2.2消化道全口无齿，口裂有角质化硬鞘。食道细而长，胃较宽大，小肠盘曲位于十二指肠后。4.2.3消化腺由肝、胰和胆等组成。肝深褐色且较大，分左右两叶，胆囊在肝叶中，胰腺乳黄色紧靠十二指肠。4.2.4肺扁平长圆囊状，2叶。鳄龟的内部结构图见图3。DB11/T371—20063（1）气管（2）食道（3）心脏（4）肝脏（5）胃（6）胰脏（7）肺脏（8）胆囊（9）卵巢（10）小肠（11）膀胱（12）脾脏（13）输卵管（14）肾脏（15）泄殖腔（16）副膀胱（17）泄殖腔孔图3鳄龟（雌性）内部结构图4.3生长不同年龄组鳄龟的体重与体厚实测值见表2。表2不同年龄组鳄龟的体重、体厚实测值组别项目1龄2龄3龄4龄体重（g）926.40±100.421200±120.521900±145.382700±210.45体厚（cm）6.89±0.407.3±0.539.8±0.4111.2±0.404.4繁殖4.4.1性成熟年龄3龄-4龄。4.4.2繁殖季节4月-6月。4.4.3年性成熟次数性成熟个体性腺每年成熟一次，一次产卵。4.4.4产卵量每只性成熟雌龟每年产卵20枚-80枚。5肌肉营养成分5.1主要营养成分鳄龟肌肉蛋白质、粗脂肪、灰分、水分等营养含量指标见表3。DB11/T371—20064表3肌肉（后肢基部）主要营养成分检测项目营养指标（%）粗蛋白19.32粗脂肪0.40灰分0.88水分77.95.2氨基酸含量表4肌肉（后肢基部）主要营养成分检测项目氨基酸含量（%）天门冬氨酸≥1.65苏氨酸≥0.86丝氨酸≥0.83谷氨酸≥2.95甘氨酸≥1.00丙氨酸≥1.10胱氨酸≥0.20缬氨酸≥0.88蛋氨酸≥0.52异亮氨酸≥0.85亮氨酸≥1.45酪氨酸≥0.68苯丙氨酸≥0.71赖氨酸≥1.52组氨酸≥0.60精氨酸≥1.10氨基酸（以鲜基计）总量≥17.68%脯氨酸≥0.786细胞遗传学特性6.1体细胞染色体2倍数2n=526.2核型公式12m+4sm+6st+2t+28cmNF=686.3染色体组型鳄龟染色体中期分裂相见图4，染色体组型见图5。DB11/T371—20065图4染色体中期分裂相图5染色体组型7生化遗传学特性肌肉的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶有8条谱带；肝脏的酯酶（EST）同工酶有5个基因座位，有5条谱带。肌肉的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶电泳图谱见图6。肝脏的酯酶（EST）同工酶电泳图谱见图7。图6肌肉的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶电泳图谱图7肝脏的酯酶（EST）同工酶电泳图谱8分子遗传学特性用20个RAPD（随机扩增多态性DNA技术，又称任意引物PCR）引物对其基因组DNA进行分析，确认引物S19的分析结果能够反应其基因组的多态性特征。引物S19序列：tgcccgtcgt见图8。＋－O＋－OEst-5Est-4Est-3Est-2Est-1DB11/T371—20066图8基因组DNARAPD图谱M：分子量标准C：对照样品G：鳄龟样品（4个样品）9检测方法9.1生物学性状测定参照GB17718规定的方法测定。9.2肌肉营养成分测定9.2.1样品制备取活体后肢基部肌肉，于105℃烘干，粉碎。肌肉各成分测定按照GB/T5009.3、GB/T5009.4、GB/T5009.5、GB/T5009.6规定的方法进行。9.2.2氨基酸取活体后肢基部肌肉，于105℃烘干，粉碎。肌肉各成分测定按照GB/T5009.3、GB/T5009.4、GB/T5009.5、GB/T5009.6规定的方法进行。9.3细胞遗传学特性检测根据GB/T18654.12的相关规定进行。9.4生化遗传学性状分析9.4.1样品制备样品加3%辅酶I液匀浆，低温离心，至上清液澄清。整个制备过程均在低温下操作。9.4.2电泳分析使用水平淀粉凝胶电泳仪。淀粉胶浓度为10%，酯酶（EST）电泳缓冲液为三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸-乙二胺四乙酸四钠盐，乳酸脱氢酶（LDH）电泳缓冲液为甲基氨基甲烷（Tris）-柠檬酸，pH值7.0。将10%浓度水解淀粉煮好后倒入制胶模内，待凝固后，切一横裂缝，用滤纸片吸取样品的上清液插入裂缝中。电泳电压为250V，电泳8h-10h，电泳恒温4℃，电泳后横切成0.2cm左右的薄片，浸入染色液中保温染色。同工酶染色液配方见附录A。9.4.3结果判定将测定结果对照图6、7谱带确定该种同工酶的编码座位数和多态座位的基因数。9.5分子遗传学特性分析9.5.1基因组DNA的提取纯化DB11/T371—20067取肌肉剪碎用组织列解液（0.5molEDTA，PH值8.0；200μg/mLProteinnseK；0.5%Snrcosyl）于55℃消化过夜，次日用酚、氯仿、异戊醇（24：24：1）抽提三次，RNaseA消化去除RNA后再抽提一次，然后用2150mmol/LTris.HCl(pH8.0)、10mmolEDTA（pH8.0），透析至OD270＜0.05，检测DNA浓度，置4℃保存备用。9.5.2RAPD引物及扩增条件用PE-9600型PCR扩增仪，RAPD扩增引物OPP及OPM组计15个。RAPD反应：10mmol/LTris.HCl（pH8.3），50mmol/LKCl，2.0mmol/LMgCl2，0.001%明胶；Dapt.dGTP、Dctp，dTTP各为0.1mmol/L:引物15μg，基因组DNA20μg，1单位Tag聚合酶。于93.5℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，计45个循环，循环结束后延伸5min，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。9.5.3琼脂糖凝胶电泳凝胶浓度为1.5%的琼脂糖，胶中含0.5g/mL溴化乙锭。电泳缓冲液为TBE，电泳在室温下进行，电压为15V，电泳时间为16h。电泳毕在紫外灯下观察拍照。10检测规则10.1检测分类检测分为鉴定检测和质量一致性检测。10.2检测项目鉴定检测项目包括外部形态特征、可量性状、可数性状。质量一致性检测项目包括细胞遗传学特性、生化遗传学特性、分子遗传学特性。10.3取样样品龟的抽样按GB/T18654.2规定执行。10.3.1组批以同龄期的鳄龟为同一批。10.4判定规定各项检验指标在标准范围内则判定为鳄龟良种。DB11/T371—20068附录A（规范性附录）同工酶染色液配方A.1酯酶染色液配方酯酶染色液配方见表A.1表A.1酯酶染色液配方α-乙酸萘酯（mg）坚牢蓝B盐（mg）三羟甲基氨基甲烷-柠檬酸缓冲液（1mol，PH7.0）(mL)蒸馏水(mL)401001010A.2乳酸脱氢酶染色液配方乳酸脱氢酶染色液配方见表A.2。表A.2乳酸脱氢酶染色液配方乳酸钠(mL)辅酶I(mg)氮蓝四唑(mg)吩嗪甲硫酸(mg)三羟甲基氨基甲烷-柠檬酸缓冲液（1mol，PH8.6）(mL)蒸馏水(mL)0.56211010