DB 21 3004-2013 牛羊组织中β-受体激动剂残留检测 超高效液相色谱-串联质谱法

ICS67.050X22辽宁省地方标准DB21DB21/3004—2013牛羊组织中β-受体激动剂残留检测超高效液相色谱-串联质谱法Determinationofβ-agonistsresiduesincattleandsheeptissuesbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry2013-03-08发布2013-09-08实施辽宁省卫生厅发布DB21/3004—2013目次前言.................................................................................Ⅱ1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13测定方法...........................................................................13.1方法原理.........................................................................13.2试剂.............................................................................13.3仪器和设备.......................................................................23.4测定步骤.........................................................................23.5结果计算和表述...................................................................44检测方法灵敏度、准确度和精密度.....................................................54.1灵敏度...........................................................................54.2准确度...........................................................................54.3精密度...........................................................................55附录A（资料性附录）β-受体激动剂特征离子质量色谱图.................................6A.1标准溶液特征离子质量色谱图.......................................................6A.2空白加内标样品溶液特征离子质量色谱图.............................................7A.3回收样品溶液特征离子质量色谱图...................................................8ⅠDB21/3004—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009规定编制。本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口并解释。本标准由辽宁省卫生厅发布。本标准参照农业部1025号公告-18-2008动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法。本标准起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）。本标准主要起草人：刘敬先徐丽佳苗翠刘笑王丽娜李楠李廷曹忠君程屹马雷赵小冬。ⅡDB21/3004—2013牛羊组织中β-受体激动剂残留检测超高效液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗单个或混合物残留量的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法农业部1025号公告-18-2008动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法3测定方法3.1方法原理试料中的β-受体激动剂残留经乙酸铵提取和β-盐酸葡萄糖醛苷酶的酶解后，用高氯酸沉淀提取液中蛋白和部分杂质，调pH值过混合阳离子固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法测定。3.2试剂以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。3.2.1标准品：特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗，纯度均≥95.0%。3.2.2同位素内标：克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3，纯度均≥92.0%。3.2.3甲醇：色谱纯（FisherScientific）。3.2.4乙腈：色谱纯（FisherScientific）。3.2.5甲酸：色谱纯，纯度≥99.0%。3.2.6甲酸水溶液（0.2%）：取1mL甲酸至500mL容量瓶中，用水定容至刻度。3.2.7乙酸铵：分析纯，含量≥98.0%。3.2.8乙酸铵缓冲液（0.2mol/L）：称取15.4g乙酸铵，溶解于1000mL水中，用适量乙酸调pH值至4.6。3.2.9高氯酸：分析纯，含量为70%~72%。3.2.10氢氧化钠：分析纯，含量≥96.0%3.2.11氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取40g氢氧化钠到200mL烧杯中，加入100mL水后，摇匀放冷。3.2.12氨水：分析纯，含（NH3）量为25%~28%。3.2.13氨化甲醇溶液（5%）：取5mL氨水至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。3.2.14β–盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（β-Glucuronidase/arylsulfatase，2mL，MerckGermany）。1DB21/3004—20133.2.15标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗对照品，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备液，2~8℃冰箱中保存，有效期为3个月。3.2.16混合标准中间液（1μg/mL）：分别准确吸取1.0mL的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，2~8℃冰箱中保存，有效期为1个月。3.2.17同位素内标储备液（100μg/mL）：分别取三种同位素内标，各自用甲醇配成浓度约为100μg/mL的储备液，2~8℃冰箱中保存，有效期为3个月。3.2.18混合同位素内标工作液（100μg/L）：将上述三种同位素内标储备液，用0.2%甲酸水溶液稀释成约100μg/L的混合工作液，2~8℃冰箱中保存，有效期为1个月。3.2.19混合标准及内标工作液（10μg/L）：准确吸取1.0mL的混合标准中间液（3.2.16）和10.0mL混合同位素内标工作液（3.2.18）至100mL容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，2~8℃冰箱中保存，有效期为1周。3.3仪器和设备3.3.1超高效液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）。3.3.2涡旋混合器。3.3.3冷冻离心机。3.3.4恒温定时振荡器。3.3.5旋转蒸发仪。3.3.6固相萃取装置。3.3.7MCX固相萃取柱(CNW，forβ-agonists)：60mg/3mL。3.3.8氮吹仪。3.4测定步骤3.4.1样品处理试料的制备包括：——取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎后，以10000r/min的转速均质5min使其均匀。——上述制备过的牛肉、牛肝、羊肉、羊肝样品，于-20℃以下贮存。——取均质后的供试料品，作为供试试样。——取均质后的空白样品，作为空白试样。——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为阳性添加试料。3.4.2酶解准确称取2g±0.02g试样于50mL离心管内，加入100μL内标工作液（3.2.18），再加入10.0mL乙酸铵溶液（3.2.8），再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶（3.2.14）40μL，涡旋混匀，于37℃下避光恒温振荡16h。3.4.3提取酶解后放置至室温，涡旋混匀，10000r/min高速离心10min，倾出上清液与另一50mL离心管内，加入0.5mL高氯酸（3.2.9），涡旋混匀，10000r/min离心10min后，将上清液转移至另一50mL离心管内，用NaOH溶液（3.2.11）调pH值至2.5±0.2，备用。3.4.4净化2DB21/3004—2013固相萃取柱（3.3.7）依次用甲醇、水各3mL活化，取备用液全部过柱，再依次用水、甲醇各3mL淋洗，抽干，用4.0mL氨化甲醇溶液（3.2.13）洗脱；洗脱液在50℃下用氮气吹干。残余物用0.5mL甲酸水溶液（3.2.6）溶解，涡旋混匀，过0.22μm水相微孔滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。3.4.5标准曲线的制备分别量取混合标准及内标工作液（3.2.19）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，至10mL容量瓶中，用0.2%甲酸稀释至刻度，制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/L的标准曲线。3.4.6液相色谱参考条件色谱柱：BEHC18(50mm×2.1mm，1.7μm)，或相当者；流动相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱：0min~1min，维持5%A；1min~3min，5%A线性变化至50%A；3min~4min，50%A线性变化至60%A；4min~5min，60%A线性变化至99%A；5min~5.5min，99%A线性变化至5%A；5.5min~7.5min，维持5%A；流速：0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。3.4.7质谱参考条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3.2kV；源温：120℃；雾化温度：350℃；锥孔气流速：50L/h；雾化气流速：650L/h；目标药物保留时间、母离子与锥孔电压、子离子与碰撞能量见表1、表2。表19种β-受体激动剂保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量目标药物名称保留时间（min）定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）锥孔电压(V)碰撞能量(eV)特布他林1.30225.97＞124.89225.97＞151.87225.97＞151.87302515西马特罗1.33219.98＞130.95219.98＞202.10219.98＞202.10304010沙丁胺醇1.35240.08＞146.96240.08＞222.08240.08＞146.96302010非诺特罗1.69304.05＞106.93304.05＞134.92304.05＞106.93403520氯丙那林2.07213.93＞153.82213.93＞195.86213.93＞153.823520153DB21/3004—2013表1（续）莱克多巴胺2.05302.10＞107.00302.10＞163