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ICS67.050X04浙江省地方标准DB33/T693—2008动物源性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定高效液相色谱法DeterminationofNitroimidazolesresiduesinanimalproducts—Highperformanceliquidchromatographymethod2008-05-09发布2008-06-09实施浙江省质量技术监督局发布DB33DB33/T693—2008II前言本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由浙江省水产标准技术委员会提出并归口。本标准起草单位：浙江省水产质量检测中心。本标准主要起草人：王扬、郑重莺、张海琪、宋琍琍、叶磊海、马文俊、柳怡、蒋林娟。DB33/T693—20083动物源性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了动物源性食品中甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、奥硝唑残留量的液相色谱测定方法。本标准适用于畜禽肌肉、水产品和蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、奥硝唑残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的昀新版本。不注日期的引用文件，其昀新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要用乙酸乙酯提取样品中的甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、奥硝唑，正己烷脱脂、固相萃取柱净化、反相色谱柱分离、紫外检测器检测，外标法定量。4试剂与材料所用试剂，除特别注明外，均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中二级水要求。4.1氯化钠。4.2磷酸氢二钾。4.3乙酸乙酯。4.4无水硫酸钠：650℃灼烧4h，冷却后贮存于密封的干燥器中备用。4.5浓盐酸。4.6正己烷。4.7甲醇：色谱纯。4.8乙腈：色谱纯。4.9氨水。4.10乙酸。4.11无水乙酸钠。4.12乙酸溶液(1.0mol/L)：量取57.24mL乙酸（4.10），加水定容至1000mL。4.13乙酸缓冲液（pH=4.3）：以0.82g无水乙酸钠（4.11）溶解于800mL水中，以乙酸溶液（4.12）调节pH到4.3，加水定容至1000mL。4.14盐酸溶液(1.0mol/L)：量取82.9mL盐酸（4.5），加水定容至1000mL。DB33/T693—200844.152％氨水甲醇溶液：移取2ml氨水（4.9），用甲醇（4.7）定容到100mL。4.16硝基咪唑类药物标准品：甲硝唑（C6H9N3O3）、洛硝哒唑（C6H8N4O4）、地美硝唑（C5H7N3O2）、替硝唑（C8H13N3O4S）、奥硝唑（C7H10CIN3O3）标准品纯度≥99.0%。4.17标准储备液：称取甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、奥硝唑各0.01g（精确到0.01mg），用甲醇溶解分别配制成1.0mg/mL的标准贮备液。避光-18℃以下冷藏，保存期6个月。4.18混合标准中间液：分别准确移取各组分标准储备液（4.17）1.0mL加入10mL棕色容量瓶，混合，用甲醇定容到刻度，相当于100μg/mL。避光4℃以下冷藏，保存期7天。4.19混合标准工作液：准确移取混合标准中间液（4.18）1.0mL加入10mL棕色容量瓶，用流动相定容到刻度，相当于100μg/mL。制作标准曲线时，用流动相稀释成系列浓度。临用现配。4.20固相萃取小柱：WatersOasisMCX，60mg，3mL，或性质相当者。4.21微孔滤膜：0.45μm（有机系）。5仪器与设备5.1液相色谱仪：配紫外检测器。5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g。5.3组织捣碎机。5.4恒温振荡器。5.5离心机：4000r/min。5.6旋转蒸发仪。5.7固相萃取装置。5.8旋涡混匀器。5.9氮吹仪。5.10离心管：聚丙烯，100mL，具塞。6样品制备与保存6.1样品制备取有代表性的禽肉，水产品约500g，肌肉样品要剔骨去皮，切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，用组织捣碎机绞碎，混匀，装入洁净容器,密闭，标明标记。取代表性的蜂产品样品约500g，对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀；对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。装入洁净容器，密封，标明标记。6.2试样保存禽肉，水产品等试样于-18℃以下冷冻保存。蜂蜜常温下保存备用。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。7分析步骤7.1提取称取样品10g（精确至0.01g）,置于100mL离心管（5.10），加入2.0g氯化钠（4.1）和2.0g磷酸氢二钾（4.2），混匀，加入20.0mL乙酸乙酯（4.3），40℃振荡提取60min，DB33/T693—200854000r/min离心5min，上清液经过无水硫酸钠（4.4）滤入100mL浓缩瓶，在残渣中加入20.0mL乙酸乙酯（4.3），重复提取一次，合并滤液。7.2净化将提取液于40℃以下在旋转浓缩至近干。用1.0mL盐酸溶液(4.14)和1.5mL乙酸乙酯（4.3）溶解残渣，溶液转移到10mL的离心管中，重复操作一次，溶解残渣，合并溶液转移到离心管。加入5.0mL正己烷（4.6），涡旋振荡萃取脱脂，弃去上层正己烷层，重复萃取一次，收集合并下层液。预先用2.0mL甲醇（4.7），2.0mL水活化固相色谱小柱（4.20），将提取净化液上柱，控制流速在1.0mL/min，加3.0mL水洗柱，抽干，加3.5mL氨水甲醇溶液（4.15）洗脱，收集洗脱液，40℃水浴氮气吹至约0.5mL，用流动相定容至1.0mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱测定。7.3测定7.3.1色谱条件a)色谱柱：C18柱250mm×4.6mm（i.d.），5μm或同类型号色谱柱；b)柱温：30℃；c)流动相：乙酸缓冲液（4.13）+乙腈=86＋14，V/V；d)流速：1.0mL/min；e)进样量：30μL；f)检测器波长：320nm。7.3.2色谱测定分别取30μL进样，以峰面积为纵坐标，以标准样品中各种硝基咪唑含量为横坐标，绘制工作曲线。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。7.4空白试验除不加试样外，按上述测定步骤进行。8结果计算和表述按（1）式计算试样中各种硝基咪唑药物的残留含量：1000mVCiXi××=……………………….(1)式中：Xi——试样中各种硝基咪唑的含量，单位为毫克每千克（µg/kg）；Ci——试样溶液中各种硝基咪唑的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样昀终定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值。测定结果用平行测定的算术平均值表示。9方法检测限和回收率9.1检测限本方法甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、奥硝唑的检测限均为2μg/kg。9.2回收率本方法在不同的样品基质中甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑添加浓度及回收率的实验数据见附录B表B.1。DB33/T693—20086附录A（资料性附录）硝基咪唑类药物的色谱标准图图A.1五种硝基咪唑类药物的标准品色谱图1.甲硝唑(5.8min)2.洛硝哒唑(6.7min)3.地美硝唑(9.1min)4.替硝唑(10.5min)5.奥硝唑(15.7min)图A.2五种硝基咪唑类药物的在空白大黄鱼加标色谱图1甲硝唑(5.8min)2.洛硝哒唑(6.7min)3.地美硝唑(9.1min)4.替硝唑(10.5min)5.奥硝唑(15.7min)min024681012141618Norm.-3-2.5-2-1.5-1-0.500.5112345min024681012141618024681012345DB33/T693—20087附录B（资料性附录）不同的样品基质添加浓度回收率表B.1不同的样品基质添加浓度回收率回收率（％）样品种类添加浓度（µg/kg）甲硝唑洛硝哒唑地美硝唑替硝唑奥硝唑2.088.0～92.475.4～84.777.0～81.272.1～80.164.3～68.910.092.9～95.781.5～90.080.6～89.575.8～82.562.3～70.1鸡肉100.090.1～97.483.3～89.682.6～90.178.5～83.062.2～69.12.080.3～87.377.0～89.972.5～81.570.3～79.262.0～70.110.095.3～99.178.9～91.293.7～99.275.8～85.263.0～75.8猪肉100.079.4～94.377.8～86.785.0～89.470.8～84.763.1～72.22.070.5～83.669.8～81.970.6～81.670.3～78.762.9～73.410.080.5～96.470.5～82.970.5～82.472.6～86.560.3～73.3大黄鱼100.085.3～92.476.2～87.070.3～83.476.9～89.863.2～78.92.080.6～90.277.9～86.572.1～78.472.1～80.960.3～69.410.092.1～98.181.6～88.878.6～87.181.1～88.262.8～70.4蜂蜜100.092.7～98.383.0～88.680.3～91.680.5～94.262.4～72.9