农业部869号公告-5-2007 抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法

ICS67.050X04中华人民共和国国家标准农业部869号公告-5-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法DetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproductsQualitativePCRmethodforherbicide-tolerantrapeseedMS8,RF3andtheirderivates2007-06-11发布2007-08-01实施中华人民共和国农业部发布农业部869号公告-5-2007I前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所。本标准主要起草人：卢长明、武玉花、宋贵文、吴刚、肖玲、沈平、连庆。农业部869号公告-5-20071转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了抗除草剂油菜MS8、RF3及衍生品种的转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于抗除草剂油菜MS8、RF3及其杂交种MS8×RF3等衍生品种和制品中MS8、RF3和MS8×RF3的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1HMGI/Y基因HMGI/Ygene高移动簇蛋白I/Y（HighMobileGroupProteinI/Y）基因。3.2PTA29启动子PTA29promoter来自烟草（Nicotianatabacum）花药组织特异基因TA29的启动子。3.33′g7终止子3′g7terminator来自土壤农杆菌（Agrobacteriumtumifaciens）TL-DNA基因7的终止子。3.4MS8转化体eventMS8通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因bar(抗除草剂草胺膦基因)和barnase（核糖核酸酶基因）同时导入受体油菜品种Drakkar，获得的一个抗草胺膦不育单株。3.5RF3转化体eventRF3通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因bar(抗除草剂草胺膦基因)和barstar（编码核糖核酸酶抑制物基因）同时导入受体油菜品种Drakkar，获得的一个抗草胺膦可育单株。3.6MS8转化体特异性序列event-specificsequenceofMS8农业部869号公告-5-20072MS8外源插入片段5′端与油菜基因组的连接区序列，包括3′g7终止子3′端部分序列和油菜基因组的部分序列。3.7RF3转化体特异性序列event-specificsequenceofRF3RF3外源插入片段5′端与油菜基因组的连接区序列，包括3′g7终止子3′端部分序列和油菜基因组的部分序列。3.8杂交油菜MS8×RF3canolahybridMS8×RF3油菜雄性不育系MS8和育性恢复系RF3杂交产生的F1代。4原理根据抗除草剂油菜MS8和RF3中PTA29启动子、MS8转化体特异性序列、RF3转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得266bp、159bp、284bp的预期DNA片段，检测试样中是否含有PTA29启动子、抗除草剂油菜MS8、RF3。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭（EB）溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB）,溶解于100ml水中。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠溶液：称取80.0g氢氧化钠（NaOH），加160mL水溶解后，再加水定容到200mL。5.4500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取18.6g，乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，加入适量氢氧化钠溶液（5.3），加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液（5.3）调pH至8.0，用水定容到100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.51mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.6TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.5）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.4），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.750×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷，加入300mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存备用。5.9DNA分子量标准：可以清楚的区分50bp~1000bp的DNA片段。5.10dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.11TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反应缓冲液。5.12引物。5.12.1HMGI/Y基因。农业部869号公告-5-20073hmg-F：5′-TCCTTCCGTTTCCTCGCC-3′hmg-R：5′–TTCCACGCCCTCTCCGCT-3′预期扩增片段大小206bp。5.12.2PTA29启动子序列。PTA29-F：5′-TAAGGTGGGTGGCTGGACTA-3′PTA29-R：5′-ACTTGCACCACAAGGGCATA-3′预期扩增片段大小为266bp。5.12.3MS8转化体特异性序列。RMS8-F：5′-CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC-3′RMS8-R：5′-AATTTTAAAAACTTGTGGGATGCT-3′预期扩增片段大小159bp。5.12.4RF3转化体特异性序列。Rrf3-F：5′-CAATAACTTTGTTGGGCTTATGG-3′Rrf3-R：5′-CTCGTCTCGGACCTCCGAAAACC-3′预期扩增片段大小284bp。5.13引物溶液。用TE缓冲液（5.6）分别将上述引物稀释到10µmol/L。5.14石蜡油5.15PCR产物回收试剂盒。6仪器6.1重蒸馏水发生器或超纯水仪。6.2PCR扩增仪。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4紫外透射仪。6.5凝胶成像系统或照相系统。6.6分析天平,感量0.1mg。6.7其他分子生物学实验仪器设备。7操作步骤7.1抽样按NY/T672和NY/T673规定执行。7.2制样按NY/T672和NY/T673规定执行。7.3试样预处理按NY/T674规定执行。7.4DNA模板制备按NY/T674规定执行。7.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1每个试样PCR反应设置三次重复。7.5.1.2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50μL石蜡油（有热盖设农业部869号公告-5-20074备的PCR仪可以不加石蜡油）。7.5.1.3将PCR管在台式离心机上离心10s后插入PCR仪中，进行PCR反应。7.5.1.4检测MS8转化体反应程序为：94℃变性5min；进行35次循环扩增反应（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s）；72℃延伸7min。7.5.1.5检测RF3转化体反应程序为：94℃变性5min；进行35次循环扩增反应（94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s）；72℃延伸7min。7.5.1.6检测PTA29启动子和内标准基因HMGI/Y的反应程序为：94℃变性5min；进行35次循环扩增反应（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s）；72℃延伸7min。7.5.1.7根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1PCR反应体系试剂终浓度单样品体积无菌水31.75µL10×PCR缓冲液1×5µL25mmol/L氯化镁溶液2.5mmol/L5µLdNTPs混合溶液0.2mmol/L1µL10µmol/L上游引物0.5µmol/L2.5µL10µmol/L下游引物0.5µmol/L2.5µL5U/µLTaq酶（热启动）0.025U/µL0.25µL25g/LDNA模板1g/L2.0µL总体积50µL如果10×PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，用无菌水补齐。油菜内标准基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为hmg-F和hmg-R；PTA29启动子PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为PTA29-F和PTA29-R；MS8转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为RMS8-F和RMS8-R；RF3转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为Rrf3-F和Rrf3-R。7.5.2对照PCR反应7.5.2.1在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。7.5.2.2以非转基因油菜材料提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板。7.5.2.3用含0.1%~1.0%抗除草剂杂交油菜MS8×RF3基因组DNA的样品作为阳性对照PCR反应体系的模板。7.5.2.4用无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的浓度称量琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制琼脂糖溶液，然后按每100mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。吸取7µLPCR产物与3µL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳。7.7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计农业部869号公告-5-20075扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照7.8和7.9的规定执行。7.8PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7.9PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，并对测序结果进行比对和分析，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述8.1对照样品结果分析阳性对照的PCR反应中，HMGI/Y内标准基因、基因表达调控元件PTA29启动子、MS8转化体特异性序列和RF3转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出HMGI/Y基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则重新检测。8.2试样检测结果分析和表述8.2.1HMGI/Y内标准基因和基因表达调控元件PTA29启动子得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，结果分为四种情况：a)MS8转化体特异性序列得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，R