农业部953号公告-6-2007

GB中华人民共和国国家标准农业部953号公告－6－2007转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法Detectionofgeneticallymodifiedplantsandtheirderivedproducts—QualitativePCRmethodsforBtricetocontrolinsectpests2007-12-18发布2008-03-01实施中华人民共和国农业部发布农业部953号公告－6－2007前言本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准附录A、附录B为规范性附录。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院生物技术所、上海交通大学、中国农业科学院植物保护研究所、中国农业大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：金芜军、刘信、杨立桃、张永军、黄昆仑、宋贵文、李宁、沈平、彭于发、黄文胜、宛煜嵩。本标准首次发布。农业部953号公告－6－2007转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法1范围本标准规定了转Bt基因抗虫水稻的定性PCR检测方法。本标准适用于转基因水稻及其产品中的CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本规范的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化SN/T1193-2003基因检验实验室技术要求SN/T1194-2003植物及其产品中转基因成分检测抽样和制样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1sps基因spsgene蔗糖磷酸合酶（SucrosePhosphateSynthase）基因，在本标准中用作水稻内标准基因。gos基因gosgene一个根部表达的水稻基因，在本标准中用作水稻内标准基因。3.2农业部953号公告－6－2007CaMV35S启动子CaMV35Spromoter花椰菜花叶病毒（Cauliflowermosaicvirus）35S的启动子。3.3NOS终止子NOSterminator根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）Ti质粒胭脂碱合酶（nopalinesynthase）基因的终止子。3.4cry1Ac基因cry1Acgene编码苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis）Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因。3.5cry1Ab基因cry1Abgene编码苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis）Cry1Ab杀虫晶体蛋白的基因。3.6cry1Ab/cry1Ac融合基因cry1Ab/cry1Acfusiongenecry1Ab基因与cry1Ac基因经人工拼接形成的基因。3.7转Bt基因抗虫水稻transgenicinsect-resistantricewithBt（Bacillusthuringiensis）gene通过基因工程技术将外源cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因导入水稻而培育出的抗虫水稻。3.8Ct值Cyclethreshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据转Bt基因抗虫水稻中CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因，以及水稻的内标准基因sps基因、gos基因，设计特异性引物/探针进行PCR扩增检测，以确定水稻及其产品中是否含有转Bt基因抗虫水稻成分。5试剂除非另有说明，本方法试剂均为分析纯试剂和重蒸馏水。农业部953号公告－6－20075.1琼脂糖。5.2溴化乙锭（EB）溶液：10mg/mL。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：在160mL水中加入80gNaOH，溶解后加水定容至200mL，塑料瓶中保存。5.4500mmol/LEDTA溶液（pH8.0）：称取二水乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)18.6g，加入70mL水中，加入少量10mol/LNaOH溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.51mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.6TE缓冲液（pH8.0）：分别加入1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和500mmol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.750×TAE缓冲液：称取242.2gTris，用500mL水加热搅拌溶解，加入500mmol/LEDTA溶液（pH8.0）100mL，用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容至1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。5.8加样缓冲液：称取溴酚蓝0.25g，加入10mL水，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝0.25g，用10mL水溶解；称取蔗糖50g，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存备用。5.91mol/LTris-HCl(pH7.5)称取121.1gTris碱溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至7.5，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.10苯酚：氯仿：异戊醇溶液将苯酚、氯仿和异戊醇按照25：24：1的体积比混合。5.11氯仿：异戊醇溶液将氯仿和异戊醇按照24：1的体积比混合。5.1210mg/mlRNaseA将胰RNA酶（RNaseA）溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。5.13异丙醇。5.143mol/L乙酸钠（pH5.6）农业部953号公告－6－2007称取408.3g三水乙酸钠溶解于800mL水中，用冰乙酸调pH至5.6，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.1570%乙醇(V:V)。5.16抽提液（1000ml）在600mL水中加入69.3g葡萄糖，20g聚乙烯吡咯烷酮(K30)（PVP），1gDIECA（diethyldithiocarbamicacid），充分溶解，然后加入1mol/LTris-HCl（pH7.5）100mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）10mL，加水定容至1000mL，4℃保存，使用时加入0.2%（V/V）的β-巯基乙醇。5.17裂解液（1000ml）在600mL水中加入81.7g氯化钠，20g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），20g聚乙烯吡咯烷酮(K30)（PVP），1gDIECA（diethyldithiocarbamicacid），充分溶解，然后加入1mol/LTris-HCl（pH7.5）100mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）4mL，加水定容至1000mL，室温保存，使用时加入0.2%（V/V）的β-巯基乙醇。5.18DNA分子量标准。5.19dNTPs：浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸的等体积混合溶液。5.20适用于普通PCR反应TaqDNA聚合酶（5U/μL）及其反应缓冲液。5.21适用于实时荧光PCR反应TaqDNA聚合酶（5U/μL）及其反应缓冲液。5.22植物DNA提取试剂盒。5.23石蜡油。5.24PCR产物回收试剂盒。6仪器6.1通常分子生物学实验室仪器设备。6.2PCR扩增仪。6.3实时荧光PCR扩增仪。6.4电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.5紫外透射仪。6.6凝胶成像系统或照相系统。农业部953号公告－6－20077抽样与制样按NY/T673或SN/T1194执行。8操作步骤8.1DNA提取和纯化8.1.1试样预处理按NY/T674执行。8.1.2DNA模板制备采用NY/T674所描述的方法，或经认证适用于水稻及其产品DNA提取的试剂盒方法，或按下述方法执行。DNA模板制备时设置不加任何试样的空白对照。称取200mg经预处理的试样，在液氮中充分研磨后装入液氮预冷的1.5mL或2mL离心管中（不需研磨的试样直接加入）。加入1mL预冷至4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5min，4℃条件下10000g离心15min，弃上清液。加入600μL预热到65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在65℃恒温保持40min，期间颠倒混匀5次。室温条件下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中。加入5μLRNaseA，37℃恒温保持30min。分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇溶液和氯仿：异戊醇溶液各抽提一次。室温条件下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10体积3mol/L乙酸钠溶液（pH5.6），-20℃放置2-3h。在4℃条件下，10000g离心15min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加入50μLTE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶液即为样品DNA溶液。8.1.3DNA溶液纯度测定和保存将DNA溶液适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，OD260值应该在0.05~1的区间内，OD260nm/OD280nm比值应介于1.4~2.0之间，根据OD260值计算DNA浓度。依据测得的浓度将DNA溶液稀释到25ng/μL，-20℃保存备用。8.2PCR反应（8.2.1和8.2.2选一）8.2.1方法一见附录A。8.2.2方法二农业部953号公告－6－2007见附录B。9结果表述9.1在试样的PCR反应中，未检出SPS基因和/或GOS基因，结果表述为“样品中未检出水稻成分”。9.2在试样PCR反应中，检出Bt基因，对于水稻及以水稻为唯一原料的产品，结果表述为“样品中检出转Bt基因水稻成分”；对于混合原料产品，结果表述为“样品中检出Bt基因”，需要进一步对加工原料进行检测确认。9.3在试样PCR反应中，未检出Bt基因，但检出CaMV35S启动子和/或NOS终止子，表明该样品含有转基因成分，结果表述为“样品中检出CaMV35S启动子和/或NOS终止子，未检出转Bt基因水稻成分”。9.4在试样的PCR反应中，检出水稻内标准基因，但未检出Bt基因、CaMV35S启动子和NOS终止子，结果表述为“样品中未检出转Bt基因水稻成分”。10防污染措施防污染措施应符合“SN/T1193”或“NY/T672”的规定。农业部953号公告－6－2007附录A普通PCR方法（规范性附录）A.1引物引物序列见表A.1，用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水分别将表A.1引物稀释到10µmol/L。表A.1PCR引物序列检测基因引物引物序列(5’-----3’)PCR产物大小(bp)SPSPrimer1Primer2SPS-F1:TTGCGCCTGAACGGATATSPS-R1:GGAGAAGCACTGGACGAGG277CaMV35SPrimer1Primer235S-F1:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC35S-R1:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC195NOSPrimer1Primer2NOS-F1:GAATCCTGTTGCCGGTCTTGNOS-R1:TTATCCTAGTTTGC