搜索
电子显微镜样品制备与观察河北大学生命科学学院主要内容样品的取材与固定样品的渗透与包埋修快与支持膜的制备玻璃刀的制作与超薄切片电子染色电子显微镜的使用与生物样品超微结构观察一、样品的取材与固定（一）实验目的1掌握电镜样品取材的方法与要求2掌握电镜样品的固定方法与要求（二）实验原理（见原理部分）（三）实验材料小白鼠肝脏（等）（四）实验方法1动物麻醉将小白鼠放入烧杯，放入一蘸有氯仿的脱脂棉球，用培养皿盖住烧杯口，约3～5min后小白鼠被麻醉；2解剖分割迅速解剖，取出肝脏，在硬纸上用新单面刀片分割成0.5*0.5*0.5mm3小块，迅速投入准备号的固定液；3前固定2.5%戊二醛0~4℃固定1~2h（固定液需提前准备号）；4漂洗0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次5～10min,0～4℃；5后固定1％鋨酸固定1～2h，0～4℃；6漂洗0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次5～10min,0～4℃；7脱水30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇，0～4℃，每步5～10min；8保存70％乙醇0～4℃保存。（五）实验要求1用具干燥；2取材快、准、小、轻；3鋨酸有毒，需在通风厨中进行，含鋨酸的废液放入指定容器；4每人固定2～3块样品；5在固定的过程中要不断震动样品管。二、样品的渗透与包埋（一）实验目的掌握超薄切片样品渗透与包埋的方法（二）实验原理见理论部分（三）实验材料上次保存的材料（四）实验方法1脱水85％乙醇→95％乙醇→100％乙醇→100％乙醇，每步5~10min；2置换丙酮→丙酮，每步5~10min；3渗透1/2丙酮+1/2环氧树脂1~4h；4包埋先将包埋模块加满环氧树脂，再将渗透过的材料用牙签挑到包埋模块尖端部分，并在其中渗透3~4h；5聚合加热37℃→45℃→60℃，各12h。（五）实验要求1所用器具、工具保持清洁干燥；2手上若沾有环氧树脂，用丙酮棉球擦去；每人包埋2～3个样品块。三、修快与支持膜的制备（一）实验目的1掌握超薄切片包埋块修快的方法；2掌握支持膜制备的方法。（二）实验原理见理论部分（三）实验材料上次实验包埋的材料（四）实验方法1修快（1）用样品夹头夹住环氧树脂包埋块的2/3左右，夹紧，或用手拿住样品块；（2）用小钢锉或单面刀片修快使达到下面要求：切面光滑平整，尽可能是要观察的材料，切面大小0.5*0.5mm2；3～4个斜面的坡度以45度为宜。2支持膜的制备（1）将玻璃条、250ml烧杯洗净，玻璃条先用纱布擦干，然后再用绸布用力反复擦净，250ml烧杯装满蒸馏水；（2）将玻璃条放入0.2~0.3%聚乙烯醇缩甲醛的氯仿溶液中2~4cm深，停留3~5s后提出，在空气中自然干燥；（3）在玻璃条四周用单面刀片将膜轻轻划开，然后以与水面30度角缓慢插入放在日光灯正下方的250ml烧杯的蒸馏水中，同时用眼观察(使眼正好能看到水面反射的日光灯的光线)，使膜完全脱离玻璃条而漂浮在水面上，膜应为均匀的灰色（约15nm）；（4）将2～4片载网放在膜上，再用镊子轻压1～2下，使载网与膜紧贴；（5）再用比膜稍大的滤纸放在膜的上方，轻压下滤纸一角，在滤纸刚好全部湿润之际将滤纸提起，载网与膜亦贴在滤纸上；（6）将膜向上保存于培养皿中备用。（五）实验要求1制膜所用的器具、蒸馏水、纱布、绸布必须干净，用后洗净，制膜过程要防尘；2每人修快2块，制膜2张，将修好的样品块用纸包好写上组号姓名；3预习下次实验。四、玻璃刀的制作与超薄切片（一）玻璃刀的制作（二）超薄切片五、电子染色1蜡盘的制作在培养皿中注入融化的石蜡，让其逐渐凝固；2滴加染液3铀染4水洗5铅染6水洗7干燥六、电子显微镜的使用与样品超微结构观察（一）JEM-100SX透射电子显微镜的使用1启动：闭合电子显微镜稳压电源开关与冷却循环水稳压电源开光，压下启动按钮。约30分钟后仪器进入可工作状态。2放入样品：按程序放入样品。3加高压：有下列几档可选40KV、60KV、80KV、100KV，若需高压应先加低压。选择加速电压原则：电压越高，分辨率越高，反差越小；反之，电压越低分辨率越低，反差越大。4加灯丝电源：顺时针旋转至限位处（加灯丝电源必须有高压存在），此时应看到图象，若不能看到图象，请与专职人员联系，切勿随意调整各旋钮。5观察:调整放大倍数、亮度、样品XY平移、焦距进行观察。6照相：将要照相部位移至视野中心标记方框内，过卷，调整焦距、亮度至自动曝光两个绿灯同时亮，抬起荧光屏进行曝光。7关机：将放大倍数调至1000X，调整亮度正好充满荧光屏，取出样品，灯丝旋钮调至最低，高压调至OFF，压下关闭按钮，约5分钟后仪器关闭，切断两个稳压电源开关。8记录：包括使用起至时间、观察内容、使用人及所属单位及导师，仪器工作情况。（二）样品超微结构的观察