蛋白质表达

林政•mRNA的生物合成•蛋白质生物合成•原核生物表达系统•真核生物表达系统•蛋白质的纯化方法mRNA的生物合成(转录)•目的基因•RNA聚合酶•启动子•转录终止信号•转录因子等等•启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位。某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。启动子在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件:调节型强启动子•不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA。•强启动子使外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。•带有表达目的基因的质粒，在几次细胞分裂后会丢失。•解决的办法：引入强启动子并控制目的基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。蛋白质的生物合成（翻译）•mRNA起始翻译受下列因素影响mRNA的核糖体结合位点AUG前后的核酸序列•遗传密码与tRNA•蛋白质前体的加工•蛋白质的分泌SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGUSD序列位于mRNA5`末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个bp（-3—-11bp）。SD序列与16srRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。mRNA5`-------UAAGGAGGU-----AUG16SrRNA3`-------AUUCCUCCA-------mRNA的核糖体结合位点大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列-3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是最优的碱基。AUG前后的核酸序列GCCACCAUGG-6-5-4-3-2-11234遗传密码与tRNA除了极个别情况,遗传密码在所有的有机体内是相同的,但是不同的有机体内不同密码子的使用程度不同。而这种不同是由于tRNA在不同的机体内的丰度不同。大肠杆菌人•N端fMet或Met的切除•二硫键的形成•特定氨基酸的修饰•切除新生肽链中非功能片段•多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程•糖基化，磷酸化等等蛋白质前体的加工蛋白的糖基化不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一15~36个氨基酸残基的肽段－－信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。蛋白质的分泌一些信号肽的一级结构蛋白的分泌（一）蛋白的分泌（二）革兰氏阳性菌蛋白的分泌革兰氏阴性菌蛋白的分泌理想的表达载体质粒包括：•一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点•一个调节型的强启动子•一个选择性标记•一个复制起点•一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签•一个转录终止信号•一个分泌信号肽（分泌型）表达载体融合蛋白融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用：•提高外源蛋白在表达系统中的稳定性•增加外源蛋白在表达系统中的表达量•增加目的蛋白的溶解性•作为抗原的标记蛋白•易于外源蛋白的纯化融合蛋白作为抗原的标记蛋白C-myc标记蛋白V5标记蛋白MBP麦芽糖结合蛋白Amylose树脂MBPFactorXa蛋白酶切割位点10mM麦芽糖目的蛋白融合蛋白易于外源蛋白的纯化融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化原核生物表达系统原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌大肠杆菌表达体系的优点：•积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用•易于进行遗传操作和高效表达•操作安全，致病能力低•生长迅速，培养代谢易于控制，成本相对低等等大肠杆菌表达体系的缺点•缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白•缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构,常形成不溶性包涵体(inclusionbody)•表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解•细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热大肠杆菌表达体系的转录调控P：启动子O：操纵子I：调节基因IPOCAP调控序列zya结构基因乳糖操纵元（lacoperon）：大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。z：β-半乳糖苷酶y：通透酶a：转乙酰基酶乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控而实现的：•大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。•R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的β-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。•异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactosideIPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操纵元的开放，但本身不受β-半乳糖苷酶的催化分解而十分稳定。CAP(cAMPactivatedprotein)的正调控•cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP与cAMP的受体蛋白CRP（cAMPreceptorprotein）结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的序列特征。因此RNA聚合酶难以与其结合。CAP能提高RNA聚合酶与启动子结合常数：•CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便DNA结合。•CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程应用中，通过1ac启动子-10区核苷酸突变产生的1acUV5启动子经常用于质粒表达载体中，这种启动子比野生型1ac启动子更强。•pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。•T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。•T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。•在pET表达载体的T7启动子的下游有一个lac操纵子序列，这个载体还有一个带有常规启动子以及编码lac阻遏蛋白的序列（lacI）。T7启动子、lac操纵子和lacI位置交错。•pET表达载体在λDE3溶原状态下的大肠杆菌中，lac阻遏蛋白可以作用于大肠杆菌染色体上，抑制宿主菌转录T7RNA聚合酶，也作用于T7启动子下游的lac操纵子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。(保证表达质粒在宿主菌中的稳定)T7lac启动子的调控•另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性、编码表达少量T7溶菌酶的宿主菌（pLysS和pLysE）中表达。T7溶菌酶是一种双功能蛋白：它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层，也可与T7RNA聚合酶结合，阻止转录。pLysS和pLysE•pET表达载体的功能非常强大，即使pET表达载体上的T7启动子只是造成低水平的本底表达，通常也会造成敏感宿主菌生长困难以及表达宿主中质粒不稳定。所以常用的克隆宿主菌是NovaBlue，JM109以及DH5α。表达宿主菌（pLysS和pLysE等）抗生素抗性•如果β-内酰胺酶基因位于T7启动子的下游并与之同向，虽然载体都带有天然T7转录终止子（TΦ），但是这个终止子只有大约70%的效率，T7RNA聚合酶仍能读通从而除了产生目的RNA外也有少量的β-内酰胺酶RNA，这样，诱导的培养体系中就会有β-内酰胺酶，会使氨苄青霉素降解，从而使筛选失败。宿主染色体DNA整合•如果将目的DNA直接引入宿主生物的染色体中，就能克服质粒丢失的问题。目的基因整合到宿主染色体时，染色体整合位置必须在所需的编码以外，即，DNA序列必须插入到染色体中特定的非必要位点，两个DNA分子之间只要发生同源重组即可。为了将DNA整合到染色体中，插入DNA一般至少需要与染色体DNA有50个核苷酸相同的序列。真核生物表达系统•昆虫细胞表达系统•哺乳动物细胞表达系统•酵母菌表达系统•昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白•允许插入较大的外源基因•可以胞内表达，也可以进行分泌性表达•能进行蛋白质翻译后加工:糖基化、磷酸化等等•杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的•缺点：每表达一次蛋白都要制备新的病毒，蛋白质的加工与哺乳动物还是有区别。昆虫细胞表达系统一种广泛应用的杆状病毒是多核型多角体病毒（AcMNPV），病毒在其侵染周期中，产生两种形式的病毒：单个病毒颗粒，该颗粒从受感染的细胞中释放出来后又去感染其他的细胞；多角体，多个病毒颗粒被包裹在蛋白外壳（多角体蛋白）中，当细胞裂解或宿主死亡后，多角体就释放到环境中。昆虫杆状病毒（baculovirus）单颗粒病毒粒子多角体•哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译后修饰过的外源蛋白•哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长•常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（COS）、小仓鼠肾细胞（BHK）、人的胚胎肾细胞（HEK-239）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统的表达载体酵母菌表达外源基因的优势：•全基因组已测序，表达调控机理比较清楚，遗传操作简便•具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统•能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型）•不含有特异性的病毒、不产生内毒素，ＦＤＡ认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyrecognizedasSafeGRAS)•大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉•酵母菌是最简单的真核模式生物如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。酵母菌表达系统酵母菌表达系统的宿主菌•酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）•乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）•多形汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）•巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）的特点：•具有调节型强启动子pAOX1，紧密调控编码乙醇氧化酶基因，在以甲醇为唯一碳源的情况下，细胞内总蛋白中乙醇氧化酶能达到30%，缺乏甲醇的情况下，AOX1基因完全关闭•不产生乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白•通常也分泌少量蛋白，可以简化分泌型蛋白的纯化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统的表达载体整合型表达：单交换（AOX）整合型表达单交换（HIS）整合型表达：双交换（AOX）整合型表达：多拷贝（体内）体外构建多拷贝目的基因的表达载体BglIIAGATCTTCTAGABamHIGGATCCCCTAGGFormationofN-glycansN-glycosylateAsninAsn-X-Thr（Ser）sequence，Xis