第六章(1)-分子生物学改造

蛋白质分子的生物学改造蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；天然生物材料中蛋白质含量较少；基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途;利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。蛋白质工程的主要技术之一是定点突变技术.一、定点突变利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点突变（sitedirectedmutagenesis）。定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。二、基因定点突变的意义用于研究基因的结构与功能；通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变改变蛋白质生物学活性的成功例子。加入二硫键增加蛋白质的稳定性蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（－SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（－Ｓ－Ｓ－）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性.T4溶菌酶和6种设计的变体特性酶氨基酸的位置二硫键的数目相对活性Tm39215497142164(%)(℃)wtαIleIleThrCysCysThrLeu010041.9pwtIleIleThrThrAlaThrLeu010041.9ACysIleThrThrCysThrLeu19646.7BIleCysThrThrAlaThrCys110648.3CIleIleCysThrAlaCysLeu1052.9DCysCysThrThrCysThrCys29557.6EIleCysCysThrAlaCysCys2058.9FCysCysCysThrCysCysCys3065.9wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度将Asn和Gln转换成其他氨基酸当蛋白质暴露于高温时:天冬酰胺（Asn）天冬氨酸(Asp)+NH3谷氨酰胺(Gln)谷氨酸(Glu)+NH3导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶活性也大为降低；而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰期则延长。酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性氨基酸位点酶1478半衰期（min）野生型AsnAsn13变体AAsnThr17变体BAsnIle16变体CThrIle25变体DAspAsn11酶的稳定性以在100℃时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳定减少游离Cys残基的数目在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即外源蛋白的比活性很低。利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸（Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。例如：当人β-干扰素基因（β-IFN）在大肠杆菌中表达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋白质的10%。DNA序列分析显示，β-IFN所编码的蛋白质有三个Cys残基，其中2个形成分子内二硫键，而另一个游离的Cys可能涉及到β-IFN分子间二硫键的形成，导致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。将β-IFN分子中的游离Cys残基用Ser来取代，因为Cys与Ser分子结构相似，前者有一个S原子，而后者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活性蛋白质的得率。增加酶的活性用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。天然和突变酪氨酰-tRNA合成酶活性酶Kcat(s-1)Km(mmol/L)Kcat/Km(s-1mol-1)Thr-514.72.51.860Ala-514.01.23.200Pro-511.80.01995.800改变酶的特异性突变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图三、定点突变原理（一）M13DNA寡核苷酸突变基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13和λ为最常用。M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(singlestrandedDNA,ssDNA)。当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replicationform,RF）M13（RF-M13）。广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phagedisplay)和单链核酸的制备。四、定点突变的常用方法1.基本原理再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质.为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。2.突变过程1)合成含有目的基因的正链DNA；2)合成含有特殊突变碱基的引物；3）制备异源双链DNA；4）富集和转化双链DNA分子；5）筛选突变体并鉴定（二）Kunkel定点突变法体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。具体步骤：①将待突变的基因克隆入M13DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。②Dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点突变。③双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。④结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。（三）PCR定点突变PolymeraseChainReaction（PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。Kari.B.Mullis首创。PCR进行寡核苷酸定点突变的示意图1、重叠延伸PCR（OE-PCR）首先设计两个PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率2、大引物PCR法（megaprimerPCR)先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCR法。大引物PCR定点突变技术路线（圆点指突变位点）3、环状突变PCR法定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。方法：①两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。②以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。环状突变PCR法环状突变PCR法通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性例：葡萄糖异构酶（Glucoseisomerase）用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以Pro138替代Gly138，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型长一倍，最适反应温度提高10~12C。据分析，可能由于Pro138替代Gly138引入的一个吡咯环刚好能够填充Gly138附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。通过引入二硫键提高蛋白的稳定性蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶E.coliAlkalinephosphatase:MutationofD101SWildTypeD101SAsp101Ser101二、编码基因随机突变和重组易错PCR（ErrorpronePCR）DNA改组（DNAshuffling）易错PCR（error-pronePCR）是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。方法：增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应降低一种dNTP的量（降至1％-10％）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、A配对缓冲液中另加0.5mmol/LMnCl2,Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入使用突变DNA聚合酶如Mutazyme