有机酸发酵生产

第八章有机酸发酵有机酸发酵工业是生物工程领域中的一个至要且较为成熟的分支，在世界经济发展中，占有一定的地位。有机酸在传统发酵食品中已得到广泛应用。以微生物发酵法生产且达工业生产规模的产品已达十几种。用微生物发酵法生产有机酸，以代替从水果和蔬菜等植物中提取有机酸，是近年来由于社会及市场的需要而开发出的方法。由于食品、医药、化学合成等工业的发展，有机酸需求骤增，发酵生产有机酸逐渐发展成为近代重要的工业领域。我国是世界上最早利用和发酵生产有机酸的国家之一，由于有机酸发酵是生物体内的基本代谢过程，又和人民群众的生活密切相关，近40年来，有机酸工业从无到有，尤其是近20年出现了蓬勃发展的趋势。柠檬酸和乳酸系列产品已进入国际市场，从质量及产量两方面皆具有较强的市场竞争能力；苹果酸和衣康酸已进入市场开发和大规模生产；葡萄糖酸的发酵生产已进入成熟阶段；其他新型有机酸产品的研究开发正受到国家和相关企业的高度重视、新产品和新用途将会层出不穷。众多有机酸发酵产品中，就日前市场占有率而言，其规模和发展速度仍以柠檬酸为最，它占酸味剂市场的70％左右。同时聚乳酸(PLA)塑料的问世，使L—乳酸的应用领域扩大到化工、环保等方面，因而，L-乳酸的发展前景喜人。有机酸发酵工业，它的价值不在于产量本身产生的产值，而在于它所创造的社会效益。我国发酵有机酸除醋酸外基本上都是解放以后发展起来的新兴产业，品种较全。据粗略统计，我国发酵有机酸的生产能力为278万t／a，实际产量为220万t／a(表2—1)，估算产值为39亿元。主要有机酸都以出口为主，但也有少量进口柠檬酸发酵柠檬酸是生物有机体三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在于各种生物体中，特别是柠檬、柑橘、菠萝、李、梅、桃、大花果等果实中含量较高，某些植物的叶子，如烟叶、棉叶，以及动物肌肉、骨骼、乳汁、唾液、汗、尿中也存在柠檬酸；柠檬酸(citricacid)，又名枸橼酸，学名为2—羟丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylicacid或2—羟基丙烷—1，2，3—三羧酸(2—hydroxypropane-1，2，3-tricarboxylicacid)柠檬酸的分子C6H8O7，相对分子质量为192.13。结构式为异柠檬酸是柠檬酸的同分异构体，它的羟基在2位C上。物化性质无色半透明晶体或粉末，无臭味，有强酸味。含有一水结晶物，在干燥空气中易风化。易溶于水和乙醇，溶于乙醚，无毒。相对密度为1．542，熔点153℃(无水品)。柠檬酸有两种形式存在：一种为有光泽的含有一个结晶水的柠檬酸，一般常以此种形式出售：另一种为无水柠檬酸，可防止长途远输和贮存结块。质量标准：外销应符合英国药典Bp—80；内销应符合国家食品添加剂标准((GB80)。英国药典标准(1)形状：无色结晶或白色结晶粉末；(2)溶解度：溶于1份水或1．5份乙醇(9．6％),微溶于乙醚;(3)重金属：不超过10mg／kg(以Pb计)；(4)铁：不超过50mg／kg(5)氧化物：不超过mg／kg(6)草酸盐：不超过500mg／kg；(7)水分：无水物不超过1％。，水合物不超过9％(8)硫酸灰分：不超过o．；(9)含量：不低于99．5％，不高于101％。主要技术指标产酸率：发酵液含柠檬酸160~180g/L糖转化率：90％发酵周期：5天以内收率：70％以上2．主要用途柠檬酸用途很广，因其无毒，水溶性好，酸味适度，易被吸收和价格较低等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、纺织、建筑材料、化妆品行业和其他工业部门。其中用于食品和饮料行业的为50％，医药行业为20％，化学工业为20％，化妆品为2％，其他8％。在食品工业中，柠檬酸由于其适度的酸味可增进食品味道，并能抑制微生物生长而使食品保鲜，赋予食品和饮料纯正舒适、柔和可门的酸味，既能增强食欲，又能使肠胃内摄入的纤维素、钙等物质迅速溶解。柠檬酸又是一种整合剂．它能整合钙、镁、铁等微量元素，从而防止饮料的浑浊。柠檬酸与维生素Ｃ共用又是一种良好的抗氧剂。在医药工业中，作为抗凝血剂，可防止血液中凝血的生成。还可用于生产柠檬酸钠作输血剂，生产柠檬酸铁铵作补血药。在化学工业中，柠檬酸三乙酯三丁酯可做无毒增塑剂，制食品包装璜塑料薄膜；柠檬酸三乙酯、三丁酯可作肥皂或香皂的添加剂，柠檬酸和铵盐可作防锈剂；柠檬酸锌可作为微量元素肥料使用；柠檬酸还可用于柠檬酸可溶件钾肥和复合肥料；另外柠檬酸还可制造防止型表面活性剂、皮革加脂剂等。在洗涤剂工业中，柠檬酸在无磷酸盐洗衣粉、液体洗涤剂等配方中使用。可代替三聚磷酸钠，增强洗涤刑的去污能力。在建筑工业中，可做混凝土缓凝剂，提高工程抗拉、抗压、抗冻性能，防治龟裂。在化妆品业中，可做抗氧剂和发泡剂。在油田工业方面，柠檬酸铝是一种新型油田化学品，用作水溶性聚合物的交联剂。国外在压裂、堵水、剖面调整等采油工艺中已广泛使用，提高了采油率。3．市场现状目前，世界柠檬酸的产量，仍以美国为最。柠檬酸属微利产品。柠檬酸发酵历史柠檬酸是由瑞典化学家scheere于1784年从柠檬酸果汁中提取制成，并获得结晶。1891年德国微生物学家Wehmer发现青霉菌能生产柠檬酸，其中以黑曲霉产酸最高。1923年美国弗滋公司研制成功以废糖蜜为原料浅盘法发酵生产柠檬酸，并建立了世界上第一个柠檬酸工厂，从此柠檬酸进入了工业生产新时期。1952年美国迈尔斯公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸，此后深层发酵生产工艺得到迅速发展。近年来美国迈尔斯公司采用玉米淀粉为原料，经双曲法水解淀粉为液体葡萄糖进行浓酸深层发酵，发酵液中产酸浓度达22％一23％。国外生产装置多已实现大规模自动化生产，自动化水平很高。我国柠檬酸发酵的研究工作早在20世纪50年代就开始，60年代开始进入被粉质原料和废糖蜜原料浅盘发酵中间试验。70年代，国内纷纷开展了淀粉原料和废糖蜜原料深层发酵高产菌株的选育，产酸能力不断提高。发展到目前，我国大多以薯干为原料，发酵法有浅盘和深层两种．其中以深层发酵为主，因为这种方法更有利于大规模生产。一、柠檬酸的生物合成与调节1．黑曲霉的柠檬酸生物合成途径已知生长在葡萄糖培养基上的黑曲霉存在着糖酵解途径(EMP)、磷酸戊糖途径(HMP)、三羧酸(TCA)循环和乙醛酸循环的酶系。经过多年研究，现在普遍认为，黑曲霉利用糖类产生柠檬酸的生物合成途径是：葡萄糖经EMP或HMP降解，形成丙酮酸；丙酮酸一方向氧化脱羧生成乙酰COA、另一力面经CO2固定羧化成草酰乙酸：然后草酰乙酸与乙酰COA缩合生成柠檬酸(图4-1)。二、柠檬酸发酵主要生产菌：黑曲霉柠檬酸产生菌黑曲霉在生长期和产酸期都存在着EMP和HMP代谢．说明葡萄糖的降解是通过两条途径共同完成的。但是，在生长期EMP：HMP为2·1，而产酸期两者的比例为4：1，即产酸期有80％的葡萄糖是通过EMP代谢的。这是因为在生长期处需要通过HMP提供合成核糖等所需的前体物质，产酸期葡萄糖主要通过EMP降解，对柠檬酸的发酵生产是非常重要的。因为1mol葡萄糖经EMP降解可得到2mol丙酮酸，再经脱羧和Ｃ02固定后，可使1mol葡萄糖合成1mol柠檬酸，这样就能获得较高的糖酸转化率(以质量计，葡萄粉合成柠檬酸的理论转化率为l06.7％，对—水柠檬酸的理论转化率为116.7％)：黑曲雷中也存在TＣA和乙醛酸循环的酶系。但在产柠檬酸阶段，这两个循环均被阻断或减弱。因此，合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由含二碳的羧酸来提供。已知丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸均能经催化作用固定co２而形成草酰乙酸。经证实，在黑曲霉产柠檬酸阶段主要是通过丙酮酸羧化酶的催化作用，使丙酮酸固定co２而形成草酰乙酸。从葡萄糖合成柠檬酸的总反应式为：•黑曲霉糖质发酵柠檬酸证明生产菌（黑曲霉）中80%的糖代谢走EMP途径生产菌中存在TCA的酶系，故有TCA存在草酰乙酸的来源不是由TCA供应，而是由2个CO2固定提供，故CO2固定对柠檬酸合成必不可少。由于不存在苹果酸脱氢酶丙酮酸羧化酶PEP羧激酶生物合成途径（无碳原子损失）理论转化率：106.7%C6H8O7H2O理论转化率：116.7%能量平衡EMP中底物水平磷酸化2ATPEMP途径2NADH丙酮酸氧化脱羧2NADH可以满足生产菌的维持能量消耗，不需要消耗C源经TCA来产能•2、柠檬酸合成的代谢调控第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）Δ柠檬酸和ATP对该酶有抑制生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量ΔMn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶：许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸另外发现，柠檬酸产生菌黑曲霉中除存在正常(标准)呼吸链外，还存在一旁系呼吸链，该呼吸链在完成H传递(氧化)过程中水产生ATP。由于O2是柠檬酸发酵过程生成NADH2重新氧化的H受体，故通过旁系呼吸也可以减少ATP对PFK酶的抑制作用。但是，与正常呼吸链不同．缺氧对旁系呼吸链的损伤是不可逆的，因此在产酸阶段一定要保证足够的溶氧供应。此外,柠檬酸的合成是在线粒体上，合成后则分泌于细胞外，而合成过程中有些酶则在细胞质内、因此合成过程的中间物和终产物在线粒体、细胞质和细胞外的输送、转移及其调控等问题也是十分重要的。至于柠檬酸生物合成在基因和分子水平上的调节，这里就不作讨论了。3．正烷烃为原料的柠檬酸合成与调节（1）以正烷烃为原料合成柠檬酸是利用酵母为生产菌种的。（2）首先是将烷烃氧化成相应的脂肪酸，然后经β-氧化作用生成乙酰CoA。乙酰CoA(或乙酸、乙醇)经过TCA循环和乙醛酸循环生成草酰乙酸，并且再缩合成柠檬酸。（3）由正烷烃生物合成柠檬酸不涉及CO2固定，但合成柠檬酸的草酰乙酸必须出乙醛酸循环获得。因此，柠檬酸必须转化至异柠檬酸并进行裂解。这是酵母菌利用正烷烃发酵柠檬酸时终产物除柠檬酸外，一定存在异柠檬酸的原因。（4）在酵母的烷烃发酵中，柠檬酸的积累是在培养基氮源耗尽后开始的，由于这时细胞内AMP急剧下降，抑制了NAD异柠檬酸脱氢酶，使柠檬酸的合成大于分解，从而大量积累柠檬酸：至于为什么也积累大量异柠檬酸(有时占总量的50％)，可能是与反应中几种酶在细胞内存在的部位不同有关；二、柠檬酸发酵的生产菌种1．柠檬酸的产生菌国内外研究者都检测到大部分黑曲霉都能产生柠檬酸。此外，泡盛曲霉、温特曲霉、字佐美曲霉、海枣曲霉、炭黑曲霉、棒曲霉和斋藤曲霉，也能大虽分泌柠檬酸。但是目前用于工业化的生产菌种几乎都是黑曲霉。但是，以石油、乙酸、乙醇等为原料时，似乎都是酵母才能作为柠檬酸的生产菌株：如解脂假丝酵母、热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母等假丝酵母，以及毕赤酵母、汉逊酵母和红酵母属菌种也都能发酵正烷烃产生柠檬酸。但是酵母利用石油原料生产柠檬酸时几乎无一例外地伴随着产生相当数量的异柠檬酸。除霉菌和酵母外，不少细菌，如节杆菌、诺卡苗、放线菌、毛霉、木霉等也能产生少量柠檬酸。2、高产柠檬酸菌株的特征一般高产：柠檬酸的菌株都具有一定的生理或形态特征。对于黑曲霉其主要特征有：①在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，形成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；②能耐受高浓度的葡萄糖并产生大量酸性α-淀粉酶和糖化酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部分活力；③能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；④能抗微量金属离子，特别是抗Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+等金属离子；⑤在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球；⑥具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或少