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ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2325—2014猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法MethodofRT-PCRforthedetectionoftransmissiblegastroenteritisvirus2014-07-05发布2014-09-05实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2325—2014I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武、谷志大、赵晓彤、陈瑶、赵凤菊、赵培、闫明媚、兰德松、关乃鹏、关淼、孙世宇、华泽军、刁贺军、王志国DB21/T2325—20141猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于猪传染性胃肠炎的诊断和监测，适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中TGEV核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：碱基对（basepair）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：HSTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒（avianmyeloblastosisvirus）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）4原理TGEV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5仪器和器材DB21/T2325—20142本技术规范中需使用的主要仪器和器材有高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱（2~8℃，-20℃和-70℃三种）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管、0.2mL离心管、微量移液器和吸头。6试剂和材料6.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃预冷。6.3异丙醇：4℃预冷。6.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121（±2）℃，高压灭菌15min。6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP（10mmol/L）。6.9用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列如下：上游引物F：5′-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3′下游引物R：5′-CAACCCAGACAACTCCATCTA-3′6.10反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。6.11反转录引物：OligodT-AdaptorPrimer（2.5μmol/L）。6.12阴性对照：DEPC水。6.13阳性对照：TGEV细胞培养物。6.14PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.15TAE：三羟甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓冲液。6.16溴化乙锭。6.17DL2000DNAMarker。注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。DB21/T2325—201437.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。7.1.3肠内容物的采集与前处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.1.4粪便的采集与前处理用药匙采取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS（见附录A），混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.1.5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6存放与运送采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2RT-PCR检测7.2.1RNA提取在核酸提取室进行。7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混匀15s（也可以用手反复颠倒混匀）。4℃12000g离心15min。7.2.1.3取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)。取7.1.2中离心后的上清液约500μL转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15min。7.2.1.44℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙醇。7.2.1.54℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。7.2.1.64000g离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3~10min。7.2.1.7加入18μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；于-70℃冰箱长期保存。7.2.2反转录7.2.2.1反转录体系DB21/T2325—20144建立10μL的反应体系，按下列组分加入离心管中：MgCl22μL10×RTBuffer1μLRNaseFreedH2O2.75μLdNTPMixture(各10mM)1μLRNaseInhibitor0.25μLAMVReverseTranscriptase*10.5μLOligodT-AdaptorPrimer0.5μL实验样品RNA2μL7.2.2.2反转录条件42℃1h；95℃5min；5℃5min。7.2.3PCR7.2.3.1PCR反应体系建立50μL的反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：5×PCRBuffer10μL灭菌蒸馏水27.75μLHSTaqDNA聚合酶0.25μL上游特异性PCR引物1μL下游特异性PCR引物1μL反转录产物10μL7.2.3.2PCR反应条件94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸10min。7.2.3.3电泳将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1.2%琼脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳25min。8结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在276bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现276bp扩增条带为TGEV核酸阳性，未出现276bp扩增条带的样品判为TGEV核酸阴性。DB21/T2325—20145图注：M—DL2000DNAMarker，N—阴性对照，P—阳性对照，1、3、5—阳性样品，2、4—阴性样品图1PCR扩增产物电泳检测结果DB21/T2325—20146附录A（规范性附录）A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H20）71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20）31.21g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，用无离子水溶解稀释至5000mL，4℃保存。A.2电泳缓冲液（50倍）A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至100mLA.2.2TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓冲液（50倍）羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)100mL灭菌双蒸水加至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.31.2%琼脂糖凝胶琼脂糖（电泳级）1.2gTAE电泳缓冲液（50倍）2mL灭菌双蒸水98mL微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液10μL。A录C（规范性附_________________________________