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ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2326—2014猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法MethodofrealtimefluozescentPCRforthedetectionofpseudorabiesvirus2014-07-05发布2014-09-05实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2326—2014I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：陈瑶、赵晓彤、于学武、赵凤菊、于长泳、张雅为、刘坤洋、杨国丽、邓文超、高志峰、关淼、李连昭、杨松柏DB21/T2326—20141猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus，PRV）gG和gE基因的荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于PRV的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液和细胞培养物中PRV核酸的检测，以及根据免疫背景对gE基因缺失疫苗毒与野毒感染的鉴别检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。PRV：猪伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus）HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶(HSTaqDNApolymerase)Ct值：达到阈值的循环数(cyclethreshold)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)荧光PCR：荧光聚合酶链式反应(realtimefluozescentquantitativepolymerasechainreaction)PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）4原理SYBR®GreenⅠ是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与通过PCR反应产生的双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，通过检测反应体系中SYBR®GreenⅠ荧光强度，同时测定扩增产物DNA的熔解温度，分析PCR扩增产物的单一性，以达到检测PCR产物扩增量的目的。5仪器和器材5.1仪器分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）。5.2器材DB21/T2326—20142组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。6试剂和材料6.1DNAzol®Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4~8℃保存。6.2SYBR®PremixExTaqTMⅡ（PerfectRealTime）：SYBR®GreenⅠ嵌合荧光法进行RealTimePCR反应的专用试剂，为PCRBuffer、dNTP、RNaseH、HSTaq酶以及SYBR®GreenⅠ染料的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4℃～8℃保存。6.3PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.4无水乙醇：-20℃预冷。6.575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6.6阴性对照：灭菌双蒸水。6.7阳性对照：PRV细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121（±2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。7.1.3内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（脑、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。取100mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4血液样品的采集与处理用无菌注射器采集血液，注入含1/104%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。7.1.5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6存放与运送DB21/T2326—20143采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2实时荧光PCR检测7.2.1DNA提取在核酸提取室进行。7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。7.2.1.2每管加入800μLDNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；4℃10000g离心10min。7.2.1.3取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min；4℃10000g离心5min。7.2.1.4弃上清，沿管壁缓缓加入1mL75%乙醇，混匀，4℃10000g离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。7.2.1.5用20µL灭菌双蒸水溶解沉淀，于-20℃冰箱保存备用。7.2.2扩增体系的配制在配液区进行。配制gE基因扩增反应液，设实时荧光PCR反应数为n，其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个样本检测反应体系配制见表1，向每个荧光PCR管或孔中分装23µL的反应体系。gG基因扩增反应液配制方法同gE基因。表1每个样品反应体系配制表体系组分用量终浓度备注SYBRPremixExTaqⅡ（2×）12.5µL1×上游引物F0.25µL0.2μmol/L下游引物R0.25µL0.2μmol/LROXReferenceDye（50×）0.5µL1×仅使用在ABI、Stratagene等公司的荧光PCR扩增仪上灭菌双蒸水10µL/9.5µL—总量23µL—DB21/T2326—201447.2.3加样在样本处理区进行。在各设定的荧光PCR管中加入7.2.1中制备的2µLDNA溶液。盖紧管盖，除气泡、离心。7.2.4荧光PCR扩增检测在扩增室进行。7.2.4.1将7.2.3中离心后的PCR管放入荧光PCR扩增仪内，注意检查各反应管是否盖紧，记录样品摆放次序。7.2.4.2gE和gG基因扩增反应条件均为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行；在扩增反应结束后，分析熔解曲线。8结果判定8.1阈值设定试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8.2质控标准8.2.1阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但gE基因熔解曲线于88℃左右未出现明显的峰值，gG基因熔解曲线于84℃左右未出现明显的峰值。8.2.2阳性对照Ct值30.0，并出现典型的扩增曲线，gE基因熔解曲线于88℃左右出现明显的峰值，gG基因熔解曲线于84℃左右出现明显的峰值。否则，此次试验视为无效.8.3结果描述及判定8.3.1gE基因8.3.1.1阴性无Ct值并且无典型的扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但gE基因熔解曲线于88℃左右未出现明显的峰值，表示样品中无PRV核酸。8.3.1.2阳性Ct值≦35.0，出现典型的扩增曲线，且gE基因熔解曲线于88℃左右出现明显的峰值，表示样品中存在PRV核酸。8.3.1.3可疑30.0＜Ct值＜35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则为阴性。8.3.2gG基因DB21/T2326—201458.3.2.1阴性无Ct值并且无典型的扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但gG基因熔解曲线于84℃左右未出现明显的峰值，表示样品中无PRV核酸。8.3.2.2阳性Ct值≦35.0，出现典型的扩增曲线，且gG基因熔解曲线于84℃左右出现明显的峰值，表示样品中存在PRV核酸。8.3.2.3可疑30.0＜Ct值＜35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则为阴性。8.4鉴别检测针对免疫gE基因缺失活疫苗猪群，gE基因及gG基因均阳性，表示有野毒感染；gE基因阴性，而gG基因阳性，为苗源病毒。DB21/T2326—20146附录A（规范性附录）A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H20）71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20）31.21g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，用无离子水溶解稀释至5000mL，4℃保存。A录C（规范性附_________________________________