DB34T 1998-2013 饲料中五种喹诺酮类药物的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1998—2013饲料中五种喹诺酮类药物的测定液相色谱-串联质谱法DeterminationoffivequinolonesinSeedsbyhighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry2013-12-05发布2014-01-05实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1998—2013I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心、安徽出入境检验检疫局。本标准主要起草人：徐彦辉、徐慧群、丁磊、顾亮、沈宏林、杨志才、董思恩、谭炜、盛娟、李国庆。DB34/T1998—20131饲料中五种喹诺酮类药物的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了饲料中五种喹诺酮类药物残留量测定-液相色谱串联质谱法检测方法。本标准适用于饲料中五种喹诺酮类药物残留量测定-液相色谱串联质谱法测定和确证。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理用甲醇/乙腈（50+50）提取样品中的喹诺酮类药物，经过滤和离心后，上清液经HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱测定，用阴性样品基质加标工作曲线外标法定量。4试剂4.1除非另有说明，仅使用分析纯试剂。水：为GB/T6682规定的一级水。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4甲酸：色谱纯。4.5甲酸水溶液：0.1％（体积分数）。4.6标准品：氟罗沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、双氟沙星。4.7标准储备液（1.0mg/mL）：称取0.01g（精确至0.1mg）氟罗沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、双氟沙星标准品，用甲醇溶解并定容至10.0mL棕色容量瓶中。-18℃避光保存，保存期为3个月。4.8标准工作溶液：10µg/mL。吸取适量氟罗沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、双氟沙星标准储备溶液（4.6），用甲醇配成混合标准溶液。各组分浓度为10µg/mL。4℃避光保存，保存期为3个月，使用前回温到室温。4.9HLB固相萃取柱（60mg，3mL）或其它等效柱。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源5.2电子天平：感量0.0001g。5.3电子天平：感量0.01g。DB34/T1998—201325.4匀浆机。5.5高速台式离心机（最高转速10000r/min）。5.6聚丙烯离心管（50mL）。5.7固相萃取装置。5.8超声机。6测定步骤6.1提取称取2.0克（精确到0.01g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加入20.0mL提取液（甲醇+乙腈，50+50），漩涡混匀1min，超声提取10min，10000r/min离心5min（温度5℃），取上清液。重复提取一次，合并两次上清液。合并的上清液于45℃下旋蒸至近干，用10mL水溶液（含5％甲醇）溶解后作为待净化液（若脂肪过多，可加3mL正已烷除脂，离心后取下层过柱净化）。6.2净化HLB固相萃取柱（60mg，3mL），使用前分别用6mL甲醇和6mL水活化。将待净化液以不超过1mL/min的速度过柱，弃去滤液。用3mL5％甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用5mL甲醇溶液洗脱并收集洗脱液。洗脱液于45℃下用氮气吹干，用1mL流动相定容，漩涡混匀后过0.22μm滤膜，然后进液相色谱-串联质谱测定。6.3基质加标标准工作曲线的制备将混合标准工作液（4.7）用初始流动相逐级稀释成10µg/L～200µg/L的标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品2.0g，按照6.1、6.2与试样同时进行提取和净化，用标准系列溶液定容氮吹干后的基质净化液。6.4测定6.4.1色谱条件a)色谱柱：EclipsePlus-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)或相当者；b)柱温：40℃；c)进样量：20μL；d)流速：0.3mL/min；e)流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱条件见表1。注：五种喹诺酮药物的总离子流图见附录A。表1液相色谱梯度洗脱条件时间（min）流速（mL/min）流动相A（%）流动相B（%）095539554.59010108812150.38020DB34/T1998—20133表1（续）时间（min）流速（mL/min）流动相A（%）流动相B（%）15.01406017208022208022.01955300.39556.4.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；d)雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、辅助加热气（AUX）、碰撞气（CAD）均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；e)喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；f)定性离子对、定量离子对、碰撞电压、碰撞能量见表2。表25种喹诺酮类物质的监测离子对中文名称英文名称定量、定性离子对碰撞电压(V)碰撞能量(V)定量离子对400.2〉382.120双氟沙星Difloxacin定性离子对400.2〉356.138020定量离子对370.0〉326.020氟罗沙星Fleroxacin定性离子对370.0〉269.038020定量离子对362.3〉318.320氧氟沙星Ofloxacin定性离子对362.3〉261.238020定量离子对360.0〉316.120恩诺沙星Enrofloxacin定性离子对360.0〉245.038020定量离子对332.2〉314.020环丙沙星Ciprofloxacin定性离子对332.2〉230.9380206.4.3液相色谱-串联质谱测定6.4.3.1定性测定各检测目标化合物以保留时间和两对离子的（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20％），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致，相对丰度50％、20-50％、10-20％、10％时，容许偏差分别为±20％、±25％、±30％和±50％。7结果计算DB34/T1998—20134测定结果按式（1）计算：WVCX.......................................(1)式中：X──样品中目标化合物含量，单位为微克每千克（µg/kg）；C──测定浓度，单位为微克每升（µg/L）；V──样品定容体积，单位为毫升（mL）；W──样品称样量，单位为克（g）。注：测定结果保留至小数点后二位。8方法检测限、准确度和精密度8.1方法检测限本方法在饲料中5种喹诺酮类物质（氟罗沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、双氟沙星）的检测限均为20µg/kg。8.2准确度本方法在20µg/kg～200µg/kg添加浓度的回收率均大于70％。8.3精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值应不超过算术平均值的15％。DB34/T1998—20135AA附录A（资料性附录）五种喹诺酮药物的总离子流图图A.1五种喹诺酮药物的总离子流图_________________________________