DB51T_808-2008杂交玉米品种真实性和纯度SSR分子检测技

ICS65.020.99B21DB51四川省地方标准DB51/T808—2008杂交玉米品种真实性和纯度SSR分子检测技术方法IdentifyinggenuinenessandpurityofmaizehybridusingSSRmolecularmarker2008-6-6发布2008-9-1实施四川省质量技术监督局发布食品伙伴网—2006I目次前言.................................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13术语和定义..........................................................................14原理................................................................................25试验方法……………………………………………………………………………………………………….26核心引物筛选………………………………………………………………………………………………….27品种纯度检测程序…………………………………………………………………………………………….28品种真实性检测程序………………………………………………………………………………………….29结果计算……………………………………………………………………………………………………….310检验报告……………………………………………………………………………………………………...3附录A（规范性附录）检验报告..........................................................4食品伙伴网××—2007II前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省种子站、四川省农业科学院作物研究所、成都市种子站。本标准主要起草人：杨俊品、苏秀、何芳、林勇、谭君食品伙伴网××—20071杂交玉米品种真实性和纯度SSR分子检测技术方法1范围本标准规定了玉米(ZeamaysL.)单交种、自交系的品种真实性和纯度的SSR分子标记检测方法和对检测结果的判定标准。本标准适用于玉米单交种、自交系的品种真实性和纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4404.1粮食作物作物种子禾谷类GB／T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB／T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T1432玉米品种鉴定DNA指纹方法BMTguidelines(proj.3)分子标记选择与DNA指纹库构建指南3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1简单重复序列SSR（SimpleSequenceRepeats）又称微卫星序列或短串联重复序列，是由几个核苷酸（1-5个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串联重复序列。3.2聚合酶反应PCR（PolymeraseChainReaction）一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与DNA模板两条链上的一段互补序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成DNA。如此变性退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。3.3引物Primer食品伙伴网××—20072具有游离的3’-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，与DNA模板结合后启动PCR反应。3.4核心引物CorePrimer多态性、稳定性、重复性等综合特性好，适用于真实性和纯度鉴定优先选用的引物。核心引物的选择参考BMTguidelines(proj.3)。4原理简单重复序列（SSR）分布于玉米整个基因组，每个位点上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离。不同玉米品种由于遗传结构的差异，当利用一对或多对引物经PCR扩增后会形成不同分子量大小的扩增产物，通过染色形成不同玉米品种的SSR电泳图谱，进行玉米品种真实性和纯度鉴定。5试验方法按NY/T1432-2007《玉米品种鉴定DNA指纹方法》进行。6核心引物筛选在玉米每条染色体的长臂和短臂上各选取1对引物，共计20对引物作为基本核心引物；在每条染色体的近着丝点上和根据检测实践选取20对引物作为扩展核心引物，共计40个核心引物。并筛选出代表每个引物不同谱带的标准品种。7纯度检测程序7.1样品数从供检样品中随机取400粒玉米种子按GB/T3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于300株幼苗进行检测。7.2检测程序从核心引物中筛选供检杂交种显性差异的引物3对，对供检样品进行检测。8真实性检测程序8.1样品数目供检样品为杂交种时，随机取200粒玉米种子按GB/T3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取不少于100个个体进行检测。供检样品为自交系时，随机取20粒种子按GB/T3543.4《农作物种子检验规程发芽试验》标准中规定的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机选取10个个体进行检测。8.2检测程序食品伙伴网××—200738.2.1供检样品为杂交种时，按7.2对供检样品进行纯度检测。8.2.2杂交种选择有代表性的5个个体，自交系选取10个个体，用20对基本核心引物与对照样品进行检测。8.2.3供检样品与对照样品引物位点差异数≦1时，用20对扩展核心引物进行检测。9结果计算9.1纯度鉴定电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品幼苗株数和非本品种幼苗株数，并按下列公式计算电泳测定值（品种纯度）X.供检样品幼苗株数—非本品种幼苗株数X（%）=———————————————————×100供检样品幼苗株数9.2真实性判定9.2.1对供检样品与对照样品的20个位点的DNA指纹谱带数据进行比较：引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；引物位点差异＝1，判定两个品种为相近品种；引物位点差异＝0，判定两个品种为疑同品种；9.2.2对相近品种和疑同品种，对供检样品与对照样品的40个位点的DNA指纹谱带数据进行比较：引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；引物位点差异＝1，判定两个品种为近似品种；引物位点差异＝0，判定两个品种为相同品种或极近似品种；10鉴定报告鉴定报告格式见附录A。食品伙伴网××—20074附录A（规范性附录）NO：2008——××××××检验机构检验报告产品名称：送检单位：检验类型：本报告共四页报告编制日期：二00×年月日食品伙伴网××—20075注意事项一、报告无“检验专用章”和“检验单位公章”无效。二、复制报告未加盖检验单位公章无效。三、报告无检验（制表）、审核、批准人签字无效。四、报告涂改无效。五、对检验报告若有异议，应于收到报告之日起十五日内向检验单位提出，逾期不再受理。六、被（送）检单位对提供信息的真实性负责，检验机构对该样品的检测数据负责。七、未经书面同意，本报告不得用于任何商业目的。食品伙伴网××—20076××农作物种子检验机构检验报告NO：2008——×××作物种类型号规格产品名称商标被（送）检单位检验类别生产单位标注质量样品编号批号（原编号）样品重量抽（送）样者代表数量生产日期抽样地点抽（送）样日期检验依据检验项目所用主要仪器试验环境条件共4页第3页食品伙伴网××—20077××农作物种子检验机构检验报告鉴定样品编号对照品种编号鉴定产品名称对照产品名称检验依据检测结果：检测结论：检测机构检验专用章年月日批准：审核：检验（制表）：共4页第4页食品伙伴网