DB52T 847.3-2013 施秉太子参 组织培养与无毒种苗繁育技术规程

ICS65.020.20B21DB52贵州省地方标准DB52/T847.3—2013施秉太子参组织培养与无毒种苗繁育技术规程ShibingheterophyllaTissuecultivateandnon-toxicseedbreedingtechnicalregulation2013-10-16发布2013-12-01实施贵州省质量技术监督局发布DB52/T847.3—2013I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14太子参组织培养技术................................................................25驯化移栽操作规范..................................................................46太子参优质种苗生产技术............................................................5DB52/T847.3—2013II前言本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由黔东南州质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：贵州省黔东南州农业科学院、黔东南州职业技术学院、黔东南州质量技术监督局、施秉县质量技术监督局、施秉县农业局、贵州昌昊中药发展有限公司、贵州三泓药业股份有限公司。本标准主要起草人：余春香、陈建祥、王忠平、李穗渝、杨立、金义兰、余彬情、张子仲、李会成、兰才武、陈世贵。DB52/T847.3—20131施秉太子参组织培养与无毒种苗繁育技术规程1范围本标准规定了太子参组织培养技术，如外植体的选择与处理、诱导、增殖培养、驯化移栽等操作规范。本标准规范了太子参无毒种苗快速繁育技术。本标准适用于施秉太子参脱毒组培苗快繁工厂化生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB317白砂糖的标准GB437化学试剂硫酸铜的标准GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T628化学试剂硼酸的标准GB/T647化学试剂中硝酸钾的标准GB/T659化学试剂中硝酸铵的标准GB/T664化学试剂七水合硫酸亚铁（硫酸亚铁）标准GB/T666化学试剂七水合硫酸锌（硫酸锌）的标准GB/T671化学试剂硫酸镁的技术标准GB/T1272化学试剂碘化钾的标准GB/T1274化学试剂中磷酸二氢钾的标准GB/T1401化学试剂乙二胺四乙酸二钠的标准GB3095环境空气质量标准GB3838地面水环境质量标准GB4285农药安全使用标准GB5084农田灌溉水质标准GB5749生活饮用水卫生标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB9137保护农作物的大气污染物最高允许浓度GB15618土壤环境质量标准GB/T15899化学试剂水合硫酸锰的标准GB19489实验室生物安全通用要求GB/T22278良好实验室规范原则中药材生产质量管理规范(GAP)3术语和定义DB52/T847.3—20132下列术语和定义适用于本文件。3.1太子参脱毒组培苗运用优良太子参植株茎尖、茎段作为外植体，采用植物组织培养技术，培养再生出来的脱毒试管苗。3.2初代培养将外植体进行的第一次培养。3.3继代增殖培养将外植体转接到新鲜培养基中继续培养，使其增殖、生长、分化，形成完整植株的过程。3.4原原种育种专家育成的遗传性状稳定的品种或亲本的最初一批种子，其纯度为100%。3.5原种用原原种繁殖的1～3代或按原种生产技术规程生产的达到原种质量标准的种子，其纯度在99.9%以上。4太子参组织培养技术4.1实验室要求符合GB19489和GB/T22278规定。4.2培养基的选择太子参组织培养以MS培养基为基础培养基，所用药品符合GB437、GB/T628、GB/T647、GB/T659、GB/T664、GB/T666、GB/T671、GB/T1272、GB/T1274、GB/T1401、GB/T15899的规定。4.3培养基的制备4.3.1母液的配制和保存将培养基配方扩大若干倍，一般为（10～100）倍的浓缩液体。药品配制严格按照GB/T603规定方法配制；所用水应符合GB/T6682的要求。为了避免药品交叉污染，称取药品使用的钥匙必须专药专用。将配制好的母液分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数和日期，贮存在（2～4）℃的冰箱中，贮藏时间控制在90d内。储藏期间，如有霉菌和沉淀产生，需重新配置。4.3.2植物生长调节剂母液配制和保存DB52/T847.3—20133将各种植物生长调节剂单独配成浓度为50～100mg/100ml。多数植物生长调节剂难溶于水，其溶解方法：NAA、IBA、IAA等常用少量95%的乙醇溶解，然后加热溶解，再加蒸馏水定容。6-BA、KT等先用少量1mol/L盐酸溶解，再加蒸馏水定容。所用水要符合GB/T6682的要求。配制好植物生长调节剂分别贴上标签，标签写上名称、配制浓度和日期，贮存在2～4℃的冰箱中，贮藏时间控制在90d内。储藏期间，如有霉菌和沉淀产生，需重新配置。4.3.3培养基的配制培养基由MS基础培养基、蔗糖、琼脂、水组成，蔗糖和水分别符合GB317和GB5749规定；所需蔗糖浓度3g/L，琼脂粉浓度4g/L。太子参培养基的配制流程见图1。图1太子参培养基的配制流程图4.3.3.1诱导培养基:MS+6-BA0～1.0+NAA0～0.1，按照培养基配制程序配制。4.3.3.2继代增殖培养基:MS+6-BA0.5～1.5+NAA0.01～0.1，按照培养基配制程序配制。4.3.3.3壮苗及生根培养基:MS+6-BA0+NAA0，按照培养基配制程序配制。4.3.4pH值太子参培养基最佳pH值控制在5.6～5.8，一般用pH计或pH试纸测试，常用（1mol/L）NaOH或HCl进行调整。4.3.5培养基的分装和灭菌将配制好的培养基趁热分装，分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。操作时，尽量避免将培养基粘到容器口和容器壁上，否则容易引起污染。将已分装好培养基封口并注明配制日期和培养基种类后即进行灭菌，灭菌锅内压力为0.105MPa、温度达121℃状态下保持15～20min进行灭菌。4.4环境灭菌对环境进行定期灭菌。方法是用75%乙醇或0.1%新吉尔灭进行喷洒；对无菌操作室（接种室）、培养室和准备室采用紫外灯灭菌方法；接种所用的超净工作台在空气过滤灭菌的基础上再配合使用紫外灯照射灭菌20～30min，再用75%乙醇对超净工作台表面进行擦拭。4.5接种工具灭菌接种用的工具、无菌水等必须在灭菌锅内压力为0.105MPa、温度达121℃状态下保持15～20min进行灭菌。水分母液生长调节剂蔗糖琼脂混合加热溶解定容调节培养容器洗涤干燥分装封口高压灭菌冷却凝固播种DB52/T847.3—201344.6外植体的选择与处理4.6.1选择生长健壮、无病虫害的优良太子参植株为外植体材料。4.6.2将太子参的茎尖、茎段用5-10%洗衣粉漂洗2～3min，洗去茎尖、茎段上的蜡质层及泥土、粉尘，用自来水冲洗30min后拿到接种室，用75%酒精表面消毒20s，无菌水冲洗2次；再用0.1%Hg消毒3～8min，无菌水冲洗8～10次，以除去残留消毒液。4.7外植体的诱导培养将处理好的太子参外植体，在无菌条件下，用解剖刀和解剖针在显微镜下剥离0.5～1mm的茎尖，切取茎段（每段留一个节），分别接种于诱导培养基；茎尖、茎段应插入培养基，芽不能陷入培养基中，接种后做好标记，经7～10d培养，芽开始萌动生长，30d后芽长到1～2cm，同时有少量丛芽分化。4.8继代增殖培养将诱导出的不定芽转接于继代增殖培养基中，经30d左右培养，形成丛生芽，并有少量根系分化。4.9脱毒检验获得的丛生芽须经有资质的检验单位检测，确认无毒后，进入壮苗及生根培养。4.10壮苗及生根培养将丛生芽转接到壮苗及生根培养基中，经30d左右，形成完整的试管苗，并有根系的分化。4.11培养条件培养温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000～3000lx。太子参组织培养技术流程见图2。图2太子参组织培养技术流程图5驯化移栽操作规范5.1大棚与基质消毒优良单株块根芽头或种微茎尖病毒检测脱毒苗增殖培养未脱毒苗淘汰生根培养炼苗栽培原原种2-3代繁殖商品种DB52/T847.3—20135移栽前用0.02～0.04%高锰酸钾和0.1～0.5%甲醛对大棚进行熏蒸消毒。用0.04%高锰酸钾溶液对基质消毒灭菌。5.2炼苗试管苗移栽前，将生长健壮、根5～6条，长0.5～1.0cm，带3～4叶的试管苗连同培养瓶放置移栽大棚2～3d，然后打开瓶口再放置2～3d，使试管苗逐渐适应外界环境。5.3脱毒苗移栽将驯化后的脱毒苗用镊子小心取出，洗去根部培养基，用500倍多菌灵或甲基拖布津浸泡30min，用自来水冲洗干净后，定植于已灭菌的基质（珍珠岩:腐殖土=1:2）中。移栽后用遮阳率75%的遮阳网搭小拱棚遮阳，待苗生长5～7d后拆除。5.4脱毒苗管理及种参收获5.4.1脱毒苗移栽后要注意保湿，基质内含水量保持在50～60%。移栽一周后，每周喷施1/2MS营养液1～2次，定期用500倍多菌灵或甲基拖布津喷洒杀菌剂，预防病虫害发生，在整个生长期要及时除草。5.4.2脱毒苗生长180～210d后，即可收获太子参原原种。5.5脱毒检验获得的原原种须经有资质的检验单位，按照《植物病毒检测方法》检测，确认无毒后，进入加代扩繁。6太子参优质种苗生产技术检验无毒的原原种按照DB52/T847.4《施秉太子参种植技术规程》加代扩繁，经过2～3代繁殖成为原种，原种经加代繁殖即成为生产用脱毒良种。_________________________________DB52/T847.3-2013