DBS50 015-2013 食品安全地方标准 食品中大红粉的检测方法 高效液相色谱法

ICS67.050X20DBS50重庆市地方标准DBS50/015—2013食品安全地方标准食品中大红粉的检测方法高效液相色谱法2013-06-03发布2013-10-01实施重庆市卫生局发布DBS50/015—2013I前言本标准的附录A、附录B、附录C和附录D均为资料性附录。本标准为首次发布。DBS50/015—20131食品安全地方标准食品中大红粉的检测方法高效液相色谱法1范围本标准规定了食品中大红粉的高效液相色谱检测方法。本标准适用于辣椒粉、辣椒酱、果酱、香肠、辣椒油、火锅底料及其类似食品中大红粉的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义大红粉属偶氮系列化工合成染料。分子式：C23H17N3O2，分子量：367.4，CAS号：3789-75-1，化学名：4－[（2－苯基）偶氮]－3－羟基－N－苯基－2－萘甲酰胺。4试验方法4.1原理试样中的大红粉用乙酸乙酯-环己烷（1：1）提取，经凝胶渗透色谱（GPC）净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。4.2试剂和材料除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.2.1甲醇：高效液相色谱级。4.2.2甲酸：高效液相色谱级。4.2.3丙酮：高效液相色谱级。4.2.4乙腈：高效液相色谱级。4.2.5无水硫酸钠，经650℃灼烧4h，备用。4.2.6乙酸乙酯。4.2.7环己烷。4.2.8三氯甲烷。4.2.9提取液及GPC淋洗液：将乙酸乙酯（4.2.6）和环己烷（4.2.7）等体积混合。4.2.10大红粉标准品：纯度≥95%。DBS50/015—201324.2.11大红粉标准储备液：准确称取适量大红粉标准品（4.2.10），先用少量三氯甲烷溶解，再用丙酮配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，于0℃～4℃保存。4.2.12大红粉标准工作溶液：根据需要用丙酮将标准储备液稀释成0µg/mL、0.01µg/mL、0.02µg/mL、0.04µg/mL、0.08µg/mL、0.16µg/mL、0.32µg/mL的标准工作溶液，于0℃～4℃保存。4.2.130.45m微孔滤膜，有机系。4.3仪器和设备4.3.1高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器或紫外-可见光检测器。4.3.2GPC净化系统或手工GPC净化柱（制备方法见附录A）。4.3.3天平：感量为0.01g和0.0001g。4.3.4组织捣碎机。4.3.5超声波清洗器。4.3.6旋涡混匀器。4.3.7旋转蒸发仪。4.3.8具塞塑料离心管：50mL。4.3.9离心机：转速不低于4000r/min。4.4试样的制备将液体、半固体样品混合均匀，固体样品需粉碎，制样过程中应防止样品污染或发生待测物含量的变化。4.5测定步骤4.5.1提取4.5.1.1辣椒粉等粉状样品、香肠等肉制品、辣椒酱、果酱：称取5.0g样品（辣椒酱、果酱等含水量较大的样品称取10g样品），精确至0.01g，于50mL离心管中，加入约25mL提取液（4.2.9），于漩涡混匀器上混合提取2min，再超声提取15min后，于4000r/min离心5min，上清液转移至50mL容量瓶中。再用20mL提取液（4.2.9）提取残渣，重复上述步骤，合并提取液，用提取液（4.2.9）定容至刻度，混匀，过微孔滤膜（4.2.13）后作待净化液。4.5.1.2辣椒油、火锅底料等油状样品：称取5.0g样品（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入0.5g无水硫酸钠，加入约15mL提取液（4.2.9）充分振摇，于4000r/min离心5min，将清液转移至50mL容量瓶中。再用约15mL提取液（4.2.9）溶解样品，重复提取两次，合并提取液，用提取液（4.2.9）定容至刻度，混匀，过微孔滤膜（4.2.13）后作待净化液。4.5.2净化取10mL待净化液于GPC样品管中，用GPC仪进行净化，或者取5mL待净化液用手工GPC柱净化（净化参考条件见附录A），收集洗脱液，于40℃下旋转蒸发至干，残渣用1.0mL或0.5mL丙酮溶解后，过微孔滤膜（4.2.13）后待测定。4.5.3测定4.5.3.1液相色谱检测条件a)色谱柱：ZorbaxEclipseXDBC18柱，5μm，4.6mm×150mm（或相当型号色谱柱）。DBS50/015—20133b)流动相：A：0.1%甲酸水溶液：乙腈=85:15；B：0.1%甲酸乙腈溶液：丙酮=80:20。c)梯度洗脱程序：见表1。d)流速：1.0mL/min。e)柱温：35℃。f)进样量：20L。g)检测波长：500nm。表1梯度洗脱条件流动相时间（min）A%B%0257510.0257525.0010032.0010035.0257540.025754.5.3.2液相色谱测定按设定的色谱条件（4.5.3.1），取大红粉系列标准工作溶液（4.2.12）及样液（4.5.2）等体积进样测定，样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定。在该条件下，大红粉的保留时间约为10.2min。大红粉的高效液相色谱图及其紫外-可见光谱图参见附录B中图B.1、图B.2。必要时采用液相色谱－质谱/质谱进行进一步定性确认，确认方法见附录C、附录D。4.5.3.3空白试验除不加样品外，按4.5.1~4.5.3进行。5结果计算和表述用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（1）计算试样中大红粉的含量。10001000)(210VmVVCCx.................................................................(1)式中：x——试样中大红粉的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——由标准曲线得到的样液中大红粉的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；0C——由标准曲线得到的空白试验中大红粉的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V——样液经净化后最终定容体积，单位为毫升（mL）；1V——样品提取液的总体积，单位为毫升（mL）；DBS50/015—201342V——用于GPC净化的样品提取液体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）。6测定低限高效液相色谱的测定低限为0.01mg/kg。DBS50/015—20135附录A（资料性附录）GPC仪净化和手工GPC柱净化参考条件A.1GPC仪净化参考条件（1）a）凝胶色谱净化系统GPCUltra（LCtech）；b）净化柱规格400mm×25mm（i.d）；c）净化柱填料Bio-BeadsS-X3（200～400mesh）；d）GPC淋洗液：乙酸乙酯−环己烷（1:1，v/v）；e）流速：5mL/minf）收集：弃去0s~1600s的淋洗液，收集1600s~2000s淋洗液，2000s~2300s淋洗GPC柱。A.2手工GPC柱净化参考条件A.2.1主要材料a）玻璃层析柱管：1.5cm(内径)×40cm(长度),带玻璃滤芯和活塞；b）填料Bio-BeadsS-X3（200～400mesh）；c）GPC淋洗液：乙酸乙酯−环己烷（1:1,v/v）。A.2.2手工GPC柱装填根据装填柱体积大小称取适量Bio-BeadsS-X3凝胶干粉，放在流动相中充分浸泡24h以上，将溶胀后的凝胶以湿法装入玻璃层析柱管中，用流动相淋洗柱体，使稳定后的柱床高度为30cm，注意使凝胶柱床始终浸泡在流动相中。A.2.3净化参数将手工GPC柱（A.2.2）的凝胶柱床液面放至胶床表面后，在柱下端接一量筒测定淋洗液的体积，将5mL待净化液用滴管缓慢加到凝胶柱上层，当待净化液液面降至柱床表面后，再加入流动相淋洗。弃去前45mL淋洗液,收集后20mL淋洗液,于40℃下旋转蒸发至干，残渣用0.5mL丙酮溶解后，过微孔滤膜（4.2.13）后待测定。之后继续用30mL流动相淋洗凝胶柱后供净化下一样品用。（1）非商业性声明：附录A所列GPC仪净化参考条件是在德国LCtech公司的仪器上完成的，此处列出试验用仪器型号仅提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。DBS50/015—20136AA附录B（资料性附录）大红粉标准溶液的HPLC色谱图和紫外可见光谱图大红粉的HPLC色谱图0.02.55.07.510.012.515.017.5min-4.0-3.0-2.0-1.00.01.02.03.04.0mV(x0.1)0102030405060708090%DetectorA:500nm图B.1大红粉标准溶液的HPLC色谱图大红粉的紫外可见光谱图图B.2大红粉的紫外可见光谱图DBS50/015—20137BB附录C（资料性附录）食品中大红粉的液相色谱－质谱/质谱定性确认方法C.1液相色谱－质谱/质谱分析条件C.1.1色谱柱：HypersilGold，2.1×150mm，3µm；C.1.2流动相：A(甲醇):B(0.1%甲酸水溶液)=80:20；C.1.3流速：0.2mL/min；C.1.4柱温：35℃；C.1.5进样量：10µL；C.1.6离子源：电喷雾离子源；C.1.7扫描方式：正离子；C.1.8检测方式：多反应监测（MRM）；C.1.9质谱/质谱参考条件（2）：a)鞘气流量：20arb；b)辅助气流量：10arb；c)雾化室温度：120℃；d)毛细管温度：300℃；e)喷雾电压：3000V；f)定性离子对、碰撞能量见表C.1。表C.1待测物定性离子对、碰撞能量化合物母离子（m/z）子离子碰撞能量/eV275.017大红粉368.2219.032注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳C.2质谱定性确认大红粉对照品工作溶液的选择反应监测离子色谱图参见附录D。在相同试验条件下，样品与标准品工作溶液中待测物质的色谱峰相对保留时间的偏差在2.5%以内，并且选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表C.2规定的范围，则判断样品中存在对应的被测物。表C.2使用液相色谱－质谱/质谱定性确证时相对离子丰度最大允许偏差相对丰度（基峰）/%相对离子丰度最大允许误差/%＞50±20＞20~≤50±25＞10~≤20±30≤10±50（2）非商业性声明：附录C中所列参考质谱条件是在ThermoTSQQuantumAM型液质联用仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅提供参考，并不涉及商业目的，鼓励方法使用者尝试不同厂家或型号的仪器。DBS50/015—20138CC附录D（资料性附录）大红粉的多反应监测（MRM）离子色谱图RT:0.08-10.9212345678910Time(min)01020304050607080901000102030405060708090100RelativeAbundance5.301.195.571.313.681.153.285.858.634.976.852.807.7210.279.905.301.185.611.294.075.892.996.871.077.658.3310.108.99NL:5.17E6m/z=218.9950-219.0050F:+pESISRMms2368.181[218.995-219.005,274.995-275.005]MSdhf-008_120428124602NL:1.38E7m/z=274.9950-275.0050F:+pESISRMms2368.181[218.995-219.005,274.995-275.005]MSdhf-008_120428124602图D.1大红粉标准溶液多反应监测离子色谱图D_________________________________