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ICS67.120.30X20备案号：浙江省地方标准DB33DB33/T542—2005水产品中氯霉素残留量的测定方法气相色谱-二级质谱法DeterminationofchloramphenicolresiduesinaquaticproductGasChromatography-TandemMassSpectrometry(GC-MS/MS)2005-03-04发布2005-04-05实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T542—2005I前言本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由浙江省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：浙江方圆检测集团股份有限公司、浙江工商大学本标准主要起草人：陈自力、励建荣、廖上富、盛华栋、何乔桑、鲁燕骅。DB33/T542—2005II引言目前国内外特别是欧盟国家对水产品中氯霉素残留监控特别严格，而且允许残留量都非常低，一般在1μg/kg以下。目前一般常用的检测标准都采用气相色谱法（GC-ECD）、液相色谱法（HPLC-UV）、酶联免疫吸附试验法（ELISA）及气-质联用法（GC/MS），气相色谱法（电子捕获检测器）虽然能满足灵敏度的要求，但易出现假阳性、阳性结果需进一步确证；液相色谱法（HPLC）虽操作简单，但灵敏度不高；酶联免疫吸附试验法（ELISA）具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高等优点，但容易产生假阳性，一般只适用进行样品粗筛，阳性结果需进行确证。本方法采用气相色谱离子阱时间串联质谱法测定水产品中氯霉素，灵敏度高，确证率高，稳定性好。DB33/T542—20051水产品中氯霉素残留量的测定方法气相色谱-二级质谱法1范围本标准规定了水产品中氯霉素残留量的气相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于水产品中氯霉素残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品经乙酸乙酯提取并浓缩，提取物溶于水，用正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，硅烷化试剂衍生化后，用气相色谱-二级质谱测定，外标法定量。4试剂4.1所有试剂在氯霉素出峰处应无干扰峰，最好选择优级纯或色谱纯试剂。4.2氯霉素标准品：纯度≥99％。4.3甲醇：色谱纯。4.4乙酸乙酯：色谱纯。4.5正己烷：优级纯。4.6氯仿：分析纯。4.7乙腈：色谱纯。4.8无水硫酸钠：分析纯，650℃灼烧4h，冷却后贮于密闭容器中备用。4.9氯化钠：分析纯。4.104％氯化钠溶液：称取氯化钠20g，加水溶解，稀释到500mL。4.11氯霉素标准溶液：准确称取氯霉素标准品0.050Og，用甲醇溶解并定容至100mL，配成浓度为500µg/mL的标准贮备液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过3个月。临用前，取此贮备液，用甲醇稀释成浓度为0.100µg/mL的标准工作液。4.12衍生化试剂：N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)体积比99∶1。4.13水:实验用水应符合GB/T6682中一级水标准。5仪器5.1实验室常规仪器、设备及下列各项。5.2气相色谱质谱仪：电子轰击源（EI）,离子阱串联质谱。5.3电子天平：感量0.0001g。DB33/T542—200525.4均质机。5.5离心机。5.6电热恒温水浴锅。5.7旋转蒸发器。5.8鸡心瓶：50mL、100mL。5.9离心管：50mL。5.10刻度离心管：5mL，具塞。5.11氮吹仪。5.12C18固相萃取柱，300mg。5.13固相萃取装置。5.14无水硫酸钠柱：砂芯玻璃层析柱中装无水硫酸钠5g。6测定6.1色谱条件色谱柱：VF-5MS（30m×0.25mm×0.25µm）石英毛细管柱或相当者。载气：高纯氦气（大于99.999%），恒流1.0mL/min；柱温：程序升温，150℃恒温1min，以20℃/min速率升至270℃，保持5min；进样口温度为260℃；无分流进样，进样量1µL。6.2质谱条件：离子阱温度200℃；传输线温度250℃；歧管温度45℃；光电倍增管电压补偿200Volt；灯丝电流80μA；质量扫描范围：99-250m/z；EI全谱监测离子：225、242、361、451；二级质谱母离子225；二级监测离子208；CID电压：0.7Volts；定量方法：选择208m/z为定量离子，外标法定量。7测定步骤7.1样品预处理鱼去鳞、皮，沿背脊取肌肉；虾去头、壳、附肢，取可食肌肉部分；蟹、中华鳖等取可食肌肉部分；样品切成为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀，放置冰箱中冷冻贮存备用。7.2提取将样品解冻，称取样品5g(精确到0.001g)，置于50mL离心管中，加入乙酸乙酯20mL，均质机均质1min，分散均匀，以4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到100mL鸡心瓶中。再向离心管中加乙酸乙酯10mL，用原均质机均质混合1min，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液于100mL细口鸡心瓶中，于40℃水浴中减压旋转蒸发至干。7.3脱脂净化向鸡心瓶中加1mL甲醇振荡溶解残留物，再加入15mL正己烷和25mL4％氯化钠溶液，盖塞振荡混合1min，充分混合提取脂肪，转移到另一50mL离心管中，4000r/min的速度离心2min，除去上层正己烷相并弃去。再向水相中加10mL正己烷，重复提取一遍，弃去正己烷相。水相中加入15mL乙酸乙酯，旋涡混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤于50mL鸡心瓶中。再向水相中加入5mL乙酸乙酯，重复上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并提取液于50mL鸡心瓶中，在40℃水浴中减压旋转蒸发至干。DB33/T542—20053对于净化不完全的样品可经C18固相萃取柱进一步净化。加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并转移于5mL具塞离心管中，用1mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯，于50℃～55℃的砂浴中吹氮蒸发至近干，再用1mL乙酸乙酯洗涤离心管壁并吹干。注意防潮。7.4C18柱净化注意：以下步骤必须连续做完，切莫让吸附剂变干。给每个样品准备一根C18柱，顺序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗处理C18柱，弃掉洗涤液。用5mL体积分数为5％的乙腈水溶液溶解7.3中在40℃水浴中减压旋转蒸发至干的提取物，吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否则净化效果和回收率都较差。用1mL水淋洗鸡心瓶2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液。用5mL水淋洗C18柱，让洗涤液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈将C18柱中的氯霉素洗脱，洗脱2次，每次1.5mL，合并洗脱液于5mL具塞离心管中。在温度50℃～55℃的砂浴中，用氮气吹除乙腈至近干，再用1mL乙腈洗涤离心管壁并用氮气吹干。注意防潮。7.5衍生化7.5.1试样的衍生化向干的残留物中加100µL衍生化试剂，盖塞并旋涡混合10s，在70℃烘箱中反应30min。再在50℃～55℃砂浴中用氮气流吹除多余的试剂，至样品管刚好吹干为止(过长的吹干时间可导致损失分析物)。加入0.5mL正己烷，旋涡混合10s，供气相色谱质谱分析用。7.5.2标准工作液的衍生化取适量标准工作液于5mL具塞离心管中，在温度50℃～55℃的砂浴中，用氮气吹除溶剂至干。以下按7.5.1的步骤操作。7.6样品测定分别注入1µL适当浓度的氯霉素标准硅烷化衍生物溶液及样品提取物硅烷化衍生物溶液于气相色谱质谱仪中，按上述色谱质谱条件进行分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。7.7定性测定进行样品测定时，如果检出色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在样品质谱图中，二级质谱选择的定性离子均出现，而且待测样品的离子丰度比与标准品的丰度比相一致，可确证该样品含氯霉素。标准物质衍生物的二级质谱总离子流图和二级质谱图见附录A。7.8定量测定以208为定量离子，外标法定量。7.9平行试验按以上步骤对同一样品进行平行试验测定。7.10空白试验除不称取试样后，均按上述步骤进行。7.11结果计算结果按式（1）计算：SscmAAVX…………………………………………（1）式中：X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；Sc——标准工作液衍生化定容后溶液氯霉素衍生物组分浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；A——样品中氯霉素衍生物的峰面积；AS——标样中氯霉素衍生物的峰面积；DB33/T542—20054V——样品溶液衍生化后定容体积，单位为毫升（mL）；m——样品溶液衍生化后定容溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值。通常的玻璃器皿洗涤程序对于从玻璃表面除去痕量氯霉素不总是很有效的，建议使用甲醇淋洗所有玻璃器皿，以避免污染问题。均质机清洗方法，先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸馏水浸洗。DB33/T542—20055附录A（资料性附录）标准物质衍生物二级质谱总离子流图和二级质谱图A.1标准物质衍生物(50μg/L)的二级质谱总离子流图，见图A.1。图A.1标准物质衍生物(50μg/L)的二级质谱总离子流图A.2标准物质衍生物的二级质谱图，见图A.2。图A.2标准物质衍生物的二级质谱图DB33/T542—20056附录B（资料性附录）回收率B.1在水产品中氯霉素添加浓度在0.5μg/kg～5μg/kg范围时，回收率在72.7%～93.8%之间。_____________________