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ICS65.020.01B05DB33浙江省地方标准DB33/T963—2015厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法PurityidentificationofMuskmelonvarietyusingmolecularmarkeranalysis2015-05-07发布2015-06-07实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T963—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由浙江省农业厅提出。本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：宁波市农业科学研究院、宁波市种植业管理总站。本标准主要起草人：宋慧、王毓洪、张香琴、臧全宇、陆惠斌、张庆、范雪莲。DB33/T963—20151厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法1范围本标准规定了厚皮甜瓜种子纯度分子检测方法的术语与定义、原理、试剂、仪器设备、操作步骤和样品纯度判定与计算。本标准适用于厚皮甜瓜种子纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。农业部1485号公告-4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语与定义下列术语和定义适用于本标准。3.1品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示[GB/T3543.5-1995，定义3.2]。3.2杂株某差异位点杂交失败，该位点纯合的单株。3.3杂种一代某差异位点杂交成功，该位点杂合的单株。3.4显性标记位点仅能检测显性等位基因，不能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点。3.5共显性标记位点DB33/T963—20152同时能检测出显性和隐性等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点。3.6随机扩增多态性DNA标记（RAPD）以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的TaqDNA聚合酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。3.7简单重复序列标记（SSR）根据真核生物中广泛存在的简单重复序列两端的互补保守区域设计引物。由于核心序列串联重复数目不同，PCR扩增后获得的产物长度不同，通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。4原理从厚皮甜瓜幼苗新叶中提取基因组DNA，利用分子标记进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。通过溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下发出荧光显示核酸谱带差异。不同厚皮甜瓜品种由于遗传组成不同，引物结合后扩增产物不同，出现扩增产物有和无、或者扩增片段大小不同的差异。这些差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子纯度进行鉴定。5试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂和去离子水。5.1引物5.1.1RAPDRAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）引物名称、序列及差异片段大小见表1。表1RAPD引物名称、序列及差异片段大小名称序列（5’-3’）差异片段大小（bp）RAPD-1ACCTGGACAC1200/1400RAPD-2CCACATCGGT1200/1300RAPD-3ACACCGGAAC1500RAPD-4CCGAACACGG460/5505.1.2SSRSSR（SimpleSequenceRepeat）引物名称、序列及差异片段大小见表2。DB33/T963—20153表2SSR引物名称、序列及差异片段大小名称F-序列（5’-3’）R-序列（5’-3’）差异片段大小（bp）SSR-1CAAAGGGCTACAATAACCATCATAATCACCCTATCTC225/350/400/450SSR-2CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAAC120/130/140/550/600SSR-3TGAAGAGACTACCATCCCCATTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC140/150/320/3505.2琼脂糖5.2.1RAPD使用2%普通标准凝胶琼脂糖（DNA片段分离范围500bp～20000bp）。5.2.2SSR使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖（DNA片段分离范围40bp～1000bp）。5.310g/L溴化乙锭溶液称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中。配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.410mol/L氢氧化钠溶液称取80.0g氢氧化钠（NaOH），先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。5.50.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）称取18.6g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入2g氢氧化钠，加热至完全溶解后，冷却至室温，用按本标准5.4配置氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.61mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，加入42mL盐酸，搅拌均匀。用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.7TE缓冲液（pH8.0）分别量取10mL按本标准5.6配置的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和2mL按本标准5.5配置的乙二胺四乙酸二钠溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.85×TBE缓冲液称取54g三羟甲基氨基甲烷，27.5g硼酸，先用500mL水加热搅拌溶解后，加入20mL按本标准5.5配置的乙二胺四乙酸二钠溶液，加水定容至1000mL。使用时用水稀释成0.5×TBE。5.9加样缓冲液称取1g水溶性钠型溴酚蓝于100mL水中，涡旋直到完全溶解，配制成0.15%溴酚蓝。称取1g二甲基苯腈蓝于足量水中，定容到100mL，配制成0.15%二甲基苯腈蓝。分别取1.5mL的0.15%溴酚蓝和0.15%二甲基苯腈蓝，加入100μL按本标准5.5配置的乙二胺四乙酸二钠溶液，再加入4g蔗糖，加水定容至10mL。在4℃保存。5.10DNA分子量标准5.10.1对于RAPD，选择能够清楚地区分100bp～2000bp的DNA片段的DNA分子量标准。DB33/T963—201545.10.2对于SSR，选择能够清楚地区分50bp～1500bp的DNA片段的DNA分子量标准。5.11dNTPs混合溶液将浓度为2.5mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.12TaqDNA聚合酶及PCR反应缓冲液。将TaqDNA聚合酶配制成5U/μL使用。6仪器设备6.1电子天平：感量0.01g。6.2PCR扩增仪。6.3电泳仪、电泳槽等电泳装置。6.4凝胶成像系统。6.5其他分子生物学实验室仪器设备。7操作步骤7.1抽样厚皮甜瓜种子按照每批次不少于300粒抽样。7.2取样抽样结束后，播种，待第一片真叶长至0.5cm～1cm时，即可单株取真叶样品，液氮冷冻研磨。7.3DNA模板制备按农业部1485号公告-4-2010规定执行。7.4PCR反应7.4.1每个试样PCR反应设置三次重复7.4.2在PCR反应管中按照表3和表4依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀。表3RAPD的PCR检测反应体系试剂终浓度体积（μL）无菌水/2.572.5mmol/LdNTP0.25mmol/L1.010×buffer1×1.025mmol/LMgCl22.5mmol/L1.0引物5mmol/L0.5mmol/L1.05U/μLTaq酶0.015U/μL0.0310ng/μL模板DNA3.4ng/μL3.4总体积/10DB33/T963—20155表4SSR的PCR检测反应体系试剂终浓度体积（μL）无菌水/2.462.5mmol/LdNTP0.2mmol/L1.210×buffer1×1.525mmol/LMgCl23mmol/L1.8上游引物5mmol/L0.5mmol/L1.5下游引物5mmol/L0.5mmol/L1.55U/μLTaq酶0.0133U/μL0.0410ng/μL模板DNA3.33ng/μL5总体积/157.4.3进行PCR反应。RAPD反应程序为：94℃预变性4min，进行40次循环扩增反应（93℃变性15s，40℃退火30s，72℃延伸2min。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72℃延伸6min。SSR反应程序为：94℃预变性1min，进行40次循环扩增反应（93℃变性1min，40℃退火1min，72℃延伸1min。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72℃延伸1min。7.4.4反应结束后取出PCR反应管，加入加样缓冲液，对PCR反应产物进行电泳检测。7.5PCR产物电泳检测7.5.1按20g/L和25g/L的浓度，分别称取普通琼脂糖和高分辨率琼脂糖，加入0.5×TBE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，冷却至60℃左右，将凝胶溶液轻缓倒入电泳胶板中，插上梳子，静置冷却30min以上。在盛有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中，垂直向上轻轻拔去梳子。7.5.2PCR反应管取7μLPCR产物与2μL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源，在200A电流、90V电压条件下电泳2h～3h，待加样缓冲液中的溴酚蓝距离点样孔4cm～5cm时，停止电泳。7.6凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外投射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。8样品纯度判定与计算8.1杂种一代样品纯度判定8.1.1标记的差异位点显示共显性，供试材料的带型与杂种一代双亲之一相同，则表明该材料在差异位点杂交不成功，判断为杂株；同时具有杂种一代双亲差异条带的供试材料确定为杂种一代。8.1.2标记的差异位点显示显性，供试材料在差异位点缺失，表明该材料在该差异位点杂交不成功，判断为杂株；差异位点有扩增条带的供试材料，不做杂种一代或者杂株的判定。8.2常规种样品纯度判定DB33/T963—20156供试材料在标记差异位点的扩增结果与常规种的不相同，则判断为杂株。8.3样品纯度计算样品纯度按照下列公式计算：-100%=×供检种子粒数（幼苗数）杂株种子粒数（幼苗数）品种纯度供检种子粒数（幼苗数）