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ICSDB备案号：16719-2005四川省地方标准DB51/T468—2005猪肝中维吉尼亚霉素残留检测方法—高效液相色谱（HPLC）法DeterminationofVirginimycinResiduesinPigLiverbyHighPerformanceLiquidChromatography2005-03-03发布2005-06-01实施四川省质量技术监督局发布1DB51/T468-2005前言维吉尼亚霉素是一种广谱型抗生素药物。为了规范我省无公害畜产品猪肉的生产和销售过程，保障人民的身体健康，维护生产者、经营者和消费者的合法权益，在总结国内外相关标准的基础上，制定了用高效液相色谱法测定动物可食性组织中维吉尼亚霉素残留量的标准。本标准按GB/T1.1—2000《标准的结构和编写规则》和GB/T1.2-2002《标准中规范性技术要求内容的确定方法》进行编制。本标准附录A是资料性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省兽药残留监控中心负责起草。本标准起草人:杨松沛、彭莉、岳秀英、高岚、熊浩山。2DB51/T468-2005猪肝中维吉尼亚霉素残留检测方法-高效液相色谱(HPLC)法1范围本标准规定了猪肝中维吉尼亚霉素残留量检测的制样和高效液相色谱（HPLC）测定方法。本标准适用于鲜（冻）猪肝中维吉尼亚霉素的残留量检测。检出限为50μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，而随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规则和试验方法3制样3.1试样的制备取适量新鲜或冷冻的供试猪肝组织，绞碎均浆。3.2试样的保存-20℃冰箱贮存备用。4测定方法4.1方法提要或原理动物肝组织样品中维吉尼亚霉素的提取采用基质固相扩散技术（MSPD），即通过样品和C18的混合与研磨过程，使组织的细胞破裂，细胞内部的维吉尼亚霉素等扩散进入固定相的键合相中，然后用有机溶剂将其洗脱下来，供高效液相色谱（紫外检测器）测定。4.2试剂和材料以下所用试剂，除特别注明者外，均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2.1维吉尼亚霉素对照品含维吉尼亚霉素不得少于99.0%。4.2.2甲醇色谱纯4.2.3乙腈色谱纯4.2.4正己烷3DB51/T468-20054.2.5乙酸乙酯4.2.6磷酸4.2.7磷酸二氢钠4.2.8乙二醇4.2.9维吉尼亚霉素标准储备液准确称取维吉尼亚霉素对照品100mg，加甲醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL的储备液，置-20℃冰箱中保存，有效期3个月。临用前用甲醇稀释成适宜浓度的标准工作液。4.2.10磷酸盐缓冲液（0.01mol/L）称取磷酸二氢钠1.56g，用水稀释至1000mL，用磷酸调节至PH4.0,即得。4.3.仪器和设备4.3.1高效液相色谱仪（配紫外检测器）4.3.2离心机4.3.3固相萃取装置（配考克阀）4.3.4分析天平感量0.0001g4.3.5天平感量0.01g4.3.6旋转蒸发器4.3.7振荡器4.3.8匀浆机4.3.9涡旋混合器4.3.10微孔滤膜0.45μm4.3.11实验室常用仪器和设备4.4测定步骤4.4.1试样的制备试样的制备包括——取绞碎或匀浆后的供试样品，作为供试试样。4.4.2提取和净化称取约2g的C18填料于玻璃研钵中，加入0.5g匀浆后的肝脏试料，用研杵轻轻研磨30s使其混合均匀，装入10mL的底端垫有一层滤纸的注射器中，用玻璃棒压至4mL刻度处。用8mL正己烷淋洗，抽干，弃去正己烷淋洗液，用乙酸乙酯8mL洗脱，（淋洗、洗脱流速控制在5秒钟1滴）乙酸乙酯洗脱液加入20μL乙二醇，在40℃水浴上用氮气吹至近干。用180μL流动相溶解残余物，0.45μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱测定。4.4.3标准曲线的制备准确量取适量维吉尼亚霉素标准工作溶液用流动相稀释成浓度为0.025、0.05、0.1、0.3、0.5、1.25、2.5μg/mL的系列标准溶液，供高效液相色谱测定。4DB51/T468-20054.4.4测定4.4.4.1色谱条件色谱柱：WatersC18（5μm）4.6mm×25cm（i.d.），或相当者。流动相：磷酸盐缓冲液/乙腈（V/V，64+36），0.45μm微孔滤膜过滤，脱气。流速：1.0mL/min。检测器：紫外检测器。检测波长：230nm。进样量：50μL。4.4.4.2测定法取适量试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准溶液及试样溶液中维吉尼亚霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液的高效液相色谱图见附录A中图A.1。4.5结果计算按下式计算供试组织中维吉尼亚霉素残留量(μg/kg)：CS·V·AXi=1000×AS·M式中：Xi—试料中维吉尼亚霉素的残留量(μg/kg)；CS—标准溶液中相应维吉尼亚霉素色谱峰的浓度(μg/mL)；A—试样溶液中相应维吉尼亚霉素的峰面积；AS—标准溶液中相应维吉尼亚霉素的峰面积；V—浓缩至干后，溶解残余物所用流动相的总体积（mL）；M—供试试料的质量（g）。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1灵敏度本方法在猪的肝脏组织中最低检测限为25μg/kg，最低检出限为50μg/kg。5.2准确度本方法在猪的肝脏组织中50μg/kg-500μg/kg添加浓度的回收率为60%-110%。5.3精密度本方法的批内变异系数CV≤19%，批间变异系数CV≤17%。5DB51/T468-2005附录A色谱图（资料性附录）高效液相色谱图6