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DBS22吉林省地方标准DBS22/007—2013食品安全地方标准水产品中炔诺酮的测定ELISA法2013-10-08发布2013-10-08实施吉林省卫生厅发布DBS22/007—2013I前言本标准起草单位：长春市水产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：闫先春、杨炳坤、杨立军、王雅倩、修磊。DBS22/007—20131食品安全地方标准水产品中炔诺酮的测定ELISA法1范围本标准规定了水产品中炔诺酮的酶联免疫测定方法。本标准适用于水产品中炔诺酮的快速筛选检测。本标准的检出限为2µg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法SC/T3016水产品抽样方法3原理利用ELISA抗原抗体的特异性反应，样本中残留的炔诺酮和预包被的偶联抗原竞争炔诺酮抗体，加入酶标二抗显色后，样本吸光值与其所含残留物炔诺酮的含量成负相关，外标法定量。4试剂与材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682一级水的标准。4.1亚硝基铁氰化钠（C5FeN6Na2O.2H2O）。4.2硫酸锌(ZnSO4.7H2O)。4.3乙腈。4.4氢氧化钠。4.50.36moL/L亚硝基铁氰化钠溶液:称取10.7g亚硝基铁氰化钠加100mL水溶解混匀。4.61moL/L硫酸锌溶液:称取28.8g硫酸锌加100mL水溶解混匀。4.70.1moL/L氢氧化钠溶液:称取0.4g氢氧化钠加100mL水溶解混匀。4.8乙腈-0.1moL/L氢氧化钠溶液:量取84mL乙腈加入到16mL0.1moL/L氢氧化钠溶液中混匀。4.9试剂盒提供试剂包括：96孔酶标板、标准液、高浓度标准品、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。4.10刻度移液管：10mL。4.11洗耳球。4.12玻璃试管：10mL。4.13聚苯乙烯离心管：2mL、50mL。DBS22/007—201325仪器与设备5.1酶标仪或酶联免疫分光光度计(450nm)。5.2天平：感量0.01g。5.3洗板机。5.4旋转蒸发仪/氮气吹干装置。5.5均质器。5.6振荡器。5.7涡旋仪。5.8离心机(4000r/min)。5.9微量移液器：单道20µL～200µL、100µL～1000µL、多道250µL。6测定方法6.1制备与保存6.1.1抽样：按SC/T3016-2004的方法进行。6.1.2保存：样品经处理后，取可食部分（苗种取全身）100g，用均质器捣碎，装入样品袋，标明标记，放入-18℃冰柜中冷冻保存。6.2提取纯化6.2.1称取2.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入7mL乙腈-0.1moL/L氢氧化钠溶液（4.8），加入0.36mol/L硝基铁氰化钠溶液（4.5），1moL/L硫酸锌溶液（4.6）各500µL，用振荡器振荡10min，3000r/min，室温（20℃～25℃）离心10min;6.2.2取1mL上清液至10mL玻璃试管中，于50℃～60℃水浴氮气流下吹干；6.2.3取1mL复溶工作液（4.9）复溶干燥的残留物；把提取得到的样本液与复溶工作液按照1︰4体积比进行稀释（取100µL样本液+400µL复溶工作液），涡动混匀；取50µL用于分析。6.3测定6.3.1将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20℃～25℃）平衡30min，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。6.3.2取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2℃～8℃。6.3.3洗涤工作液在使用前也需回温。6.3.4编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。6.3.5加标准品/样本和抗体工作液：加标准品/样本50µL/孔到对应的微孔中，再加入抗体工作液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。6.3.6洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（4.9）250µL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。6.3.7加酶标二抗：加入酶标二抗100µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于37℃环境中反应30min，取出重复洗板步骤6.3.6.6.3.8显色：加入底物液各50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃环境中避光显色15min。DBS22/007—201336.3.9测定：加入终止液50µL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，在5min内读完数据，测定每孔OD值。7结果计算标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值除以空白样品的吸光度值，再乘以100%，即公式（1）：%E=0AA%100………………………………………………………（1）式中：E———百分吸光度值，%；A———标准液或样品液吸光度值；A0———空白样品吸光度值。以百分比吸光度值为纵坐标，以炔诺酮标准液浓度对数值为横坐标，建立标准曲线。从标准曲线上读取待测液百分比吸光度值所对应的炔诺酮浓度，再乘以其相应的稀释倍数（20倍），即为样品中炔诺酮的浓度。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。_________________________________