DBS61 0012-2016 食品安全地方标准 蜂蜜中16种激素残留的测定 液相色谱-质谱质谱法

DBS61陕西省食品安全地方标准DBS61/0012—2016食品安全地方标准蜂蜜中16种激素残留的测定液相色谱-质谱/质谱法2016-07-01实施2016-06-01发布陕西省卫生和计划生育委员会发布DBS61/0012—2016I前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：张璐，李莹，何强，王菡，孔祥虹，邹阳，付骋宇。本标准属首次发布。DBS61/0012—20161食品安全地方标准蜂蜜中16种激素残留的测定液相色谱-质谱/质谱法1范围本标准规定了蜂蜜中16种激素残留的液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）的检测方法。本标准适用于蜂蜜中糖皮质激素（曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氢松、氟氢可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松）、雄性激素（甲睾酮、睾酮）、孕激素（孕酮）、肾上腺皮质激素（羟基醋酸去皮质酮）16种激素残留定性和定量测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样经酶解，用乙腈提取目标化合物后，经固相萃取富集净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。4试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的一级水。4.1乙腈：色谱纯。4.2甲醇：色谱纯。4.3甲酸：色谱纯。4.4二氯甲烷。4.5乙酸铵。4.6乙酸。4.7-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶（-glucuronidase/arylsufastase）：含有-葡萄糖醛苷酶134600U/mL，芳基硫酸酯酶5200U/mL。4.8无水硫酸钠：650℃灼烧4h，在干燥器中冷却至室温，贮于密封瓶中备用。4.9乙酸铵溶液（0.2mol/L）：称取15.4g乙酸铵，加入1000mL水溶解，用乙酸调节pH到5.2。DBS61/0012—201624.10二氯甲烷-甲醇（6+4，体积比）：60mL二氯己烷和40mL甲醇混合。4.110.1%甲酸水溶液：准确量取1mL甲酸加水稀释至1000mL。4.12乙腈-水溶液（1+9，体积比）：10mL乙腈和90mL水混合。4.13标准品：曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氢松、氟氢可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松龙、甲睾酮、睾酮、孕酮、醋酸去氧皮质酮，纯度均大于97%，物质英文名称及CAS号见附录A。4.14标准储备液（1mg/mL）：分别准确称10.0mg各标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，-18℃避光保存，可保存12个月。4.15混合标准中间溶液（1g/mL）：分别准确量取1mg/mL标准储备液各0.025mL，于25mL容量瓶中，用水溶解，0℃～4℃避光保存，可保存6个月。4.16混合标准使用溶液：根据需要，临时吸取一定量的混合标准中间溶液（4.15）用水稀释，配制成适当浓度的标准工作溶液0℃～4℃避光保存，可保存6个月。4.17HLB固相萃取柱（60mg，3mL）：使用前依次用6mL二氯甲烷-甲醇（4.10）、6mL甲醇、6mL水活化。4.18氨基固相萃取柱（60mg，3mL）：使用前用6mL二氯甲烷-甲醇（4.10）活化。5仪器与设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.01mg。5.3天平：感量0.01g。5.4振荡器5.5涡旋混匀器5.6高速离心机5.7固相萃取装置5.8氮吹仪5.9旋转蒸发仪5.10离心管：50mL。5.11有机系滤膜：0.22m。6试样制备与保存对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在封闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，震荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，分出0.5kg作为试样，制备好的样品置于样品瓶中，密封，并做上标记。DBS61/0012—201637测定步骤7.1提取准确称取试样5g（精确至0.01g），于50mL离心管中，加入20mL0.2mol/L乙酸铵溶液（4.9），涡旋混合，再加入-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶100L，于37℃±1℃震荡酶解12h。取出冷却至室温，加入20mL乙腈震荡提取15min，4500r/min下离心5min，取乙腈层过无水硫酸钠漏斗。再加入15mL乙腈，重复上述提取过程。合并乙腈层，40℃下旋转蒸发至近干，用10mL0.2mol/L乙酸铵溶液（4.9）溶解，待净化。7.2净化提取液（7.1）以1.5mL/min的速度上样于活化过的HLB固相萃取柱（4.17）。将小柱减压抽干。再将活化过的氨基柱（4.18）串联在HLB固相萃取柱下方。用8mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗脱并收集洗脱液，取下HLB小柱，再用2mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗氨基柱，合并洗脱液，于40℃氮气吹干，用1mL乙腈-水（4.12）溶解残渣，涡旋混匀，滤膜（5.11）过滤，供液相色谱-串联质谱测定。7.4测定7.4.1液相色谱条件色谱柱：HypersilGOLDaQ（2.1×100mm，3.0m）,或相当者；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：10.0L;流动相：乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱，洗脱条件参见附录B；7.4.2糖皮质激素质谱条件a）电离源：电喷雾离子源；b）离子化方式：负离子模式；c）检测模式：选择离子反应监测；d）喷雾电压：2500V；e）气化温度：300℃；f）鞘气（N2）：0.525L/min；g）辅助气（N2）:4.5L/min；h）离子传输管温度：300℃；i）去簇电压：2.0V；j）碰撞气（Ar）：199.9Mpa。k）特征离子参见附录C.1。7.4.3雄性激素、孕激素、肾上腺皮质激素质谱条件a）电离源：电喷雾离子源；b）离子化方式：正离子模式；c）检测模式：选择离子反应监测；d）喷雾电压：3300V；e）气化温度：300℃；f）鞘气（N2）：0.525L/min；DBS61/0012—20164g）辅助气（N2）:4.5L/min；h）离子传输管温度：300℃；i）去簇电压：2.0V；j）碰撞气（Ar）：199.9Mpak）特征离子参数见附录C.2。7.4.4测定法7.4.4.1定性测定通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与响应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5%；试样特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表1的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。表1试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对丰度（%）＞50＞20～50＞10～20≤10允许偏差（%）±20±25±30±507.4.4.2定量测定根据试样中被测样液的含量情况，按外标法，以峰面积定量。选取待测物的响应值在仪器线性响应范围内的浓度进行测定，如果超出仪器线性响应范围应进行稀释。在上述条件下，标准溶液中各目标化合物的特征离子流色谱图见附录D。7.5平行试验按照7.1至7.4所述的测定条件和步骤对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验除不称取试样外，均按7.1至7.4所述的测定条件和步骤进行。8结果计算和表达试样中各目标化合物残留量（g/kg）：按式（1）计算：………………………………(1)式中：X—供试试样中各目标化合物残留量，单位为微克每千克（g/kg）；A—试样溶液中各目标化合物的峰面积；Cs—标准工作溶液中各目标化合物的浓度，单位为微克每升（g/L）；V—样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；As—标准工作溶液中各目标化合物的浓度，单位为微克每升（g/L）；m—试样质量，单位为克（g）。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。9定量限、回收率和精密度9.1检出限DBS61/0012—20165本方法曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氢松、氟氢可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、甲睾酮、睾酮、孕酮、醋酸去氧皮质酮检出限均为1.0g/kg，醋酸泼尼松检出限为2.0g/kg。9.2回收率蜂蜜中各种激素的回收率试验数据见附录E，在1.0~5.0g/kg添加水平上的回收率范围为68.2%~102.2%。9.3精密度本方法的相对标准偏差≤15%。DBS61/0012—20166附录A（规范性附录）16种激素物质的CAS号、分子式、分子量及英文名称A.116种激素物质的CAS号、分子式、分子量及英文名称应符合表A.1的规定。表A.1化合物CAS号分子式分子量醋酸泼尼松龙PrednisoloneAcetate52-21-1C23H30O6402.48醋酸可的松CortisoneAcetate50-04-4C23H30O6402.48泼尼松龙Prednisolone50-24-8C21H28O5360.44氢化可的松Hydrocortisone50-23-7C21H30O5362.47甲基泼尼松龙Methylprednisolone83-43-2C22H30O5374.47醋酸地塞米松DexamethasoneAcetate55812-90-3C24H31FO7434.5地塞米松Dexamethasone50-02-2C22H29FO5392.46曲安西龙Triamcinolone124-94-7C21H27FO6394.44氟米松Flumethasone2135-17-3C22H28F2O5410.45氟氢可的松Fludrocortisone127-31-1C21H29FO5380.45曲安奈德TriamcinoloneAcetonide76-25-5C24H31FO6434.49醋酸氟氢松FluocinoloneAcetonide67-73-2C24H30F2O6452.49睾酮Testosterone58-22-0C19H28O2288.42甲睾酮Methyltestosterone58-18-4C20H30O2302.45孕酮Progesterone57-83-0C21H30O2314.46醋酸去氧皮质酮56-47-3C23H32O4372.51DBS61/0012—20167附录B（资料性附录）参考液相色谱条件B.116种激素的参考液相色谱条件应符合表B.1的规定。表B.1时间/min乙腈/%0.1%甲酸水/%0.020801.050503.065357.085159.0100010.0100011.0208012.02080DBS61/0012—20168附录C（资料性附录）参考质谱条件1）C.1参考质谱条件应符合表C.1和表C.2的规定。表C.1化合物保留时间(min)母离子(m/z)子离子(m/z)S-Lens电压(V)碰撞电压(eV)醋酸泼尼松龙4.12399.2324.18923339.1a16醋酸可的松4.20401.2329.38923341.1a16泼尼松龙3.26405.2280.16339329.1a21氢化可的松3.29407.3297.16632331.2a20甲基泼尼松龙3.48419.3309.16934343.2a20醋酸地塞米松4.53433.2361.29521353.2a21地塞米松3.57437.2307.16934361.2a21曲安西龙3.04439.2363.15125345.1a21氟米松3.60455.2305.07538379.1a21氟氢可的松4.06467.2349.16535421.2a15曲安奈德3.72479.3337.18026413.2a24醋酸氟氢松3.84497.3355.110534431.2a23注：对不同质