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中华人民共和国国家环境保护标准HJ755-2015水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法WaterqualityDeterminationoftotalcoliformsandfecalcoliformsPaperstripmethod（发布稿）本电子版为发布稿。请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。2015-10-22发布2015-12-01实施发布环境保护部目次前言.................................................................................................................................................ii1适用范围.....................................................................................................................................12术语与定义.................................................................................................................................13方法原理.....................................................................................................................................14试剂和材料.................................................................................................................................15仪器和设备.................................................................................................................................26样品.............................................................................................................................................27分析步骤.....................................................................................................................................38结果计算与表示.........................................................................................................................59精密度和准确度.........................................................................................................................510质量保证和质量控制.................................................................................................................611废物处理.....................................................................................................................................6附录A（资料性附录）结果判定参考图片.....................................................................................7附录B（资料性附录）最大可能数（MPN）表............................................................................8ii前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，保障人体健康，规范水中总大肠菌群和粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。本标准规定了地表水和废水中总大肠菌群和粪大肠菌群测定的纸片快速法。本标准为首次发布。本标准附录A和附录B为资料性附录。本标准由环境保护部科技标准司组织制订。本标准主要起草单位：常州市环境监测中心、环境保护部环境标准研究所。本标准验证单位：上海市环境监测中心、江苏省环境监测中心、浙江省环境监测中心、苏州市环境监测中心站、南京市环境监测中心站和泰州市环境监测中心站。本标准环境保护部2015年10月22日批准。本标准自2015年12月1日起实施。本标准由环境保护部解释。1水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法1适用范围本标准规定了测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群的纸片快速法。本标准适用于地表水、废水中总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。本方法的检出限为20MPN/L。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1总大肠菌群totalcoliforms37℃培养，24h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。2.2粪大肠菌群fecalcoliforms44.5℃培养，24h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。2.3最大可能数mostprobablenumber，MPN微生物检验常用发酵法，又称稀释法，是一种利用统计学原理定量检测微生物浓度的方法。它根据不同稀释度一定体积样品中被检微生物存在与否的频率，查表求得样品中微生物的浓度，与直接报告菌落数的平板计数法不同，它最终报告的是样品中最有可能存在的目标微生物浓度，这个以最大可能存在的浓度，就被称为最大可能数（mostprobablenumber，缩写为MPN)。3方法原理按MPN法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2，3，5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（37℃或44.5℃）培养24h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有总大肠菌群或粪大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应总大肠菌群或粪大肠菌群的浓度值。4试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂。4.1市售水质总大肠菌群和粪大肠菌群测试纸片：10ml水样量纸片、1ml水样量纸片按以下方法进行质量鉴定，达到要求后方可使用。（1）外层铝箔包装袋应密封完好，内包装聚丙烯塑膜袋无破损。（2）纸片外观应整洁无毛边，无损坏，呈均匀淡黄绿色，加去离子水或蒸馏水后呈紫色，无论加水与2否，应无杂色斑点，无明显变形，表面平整。（3）纸片加入相应水样，充分浸润、吸收后，将内包装聚丙烯塑膜袋倒置，袋口应无水滴悬挂。（4）纸片以去离子水或蒸馏水充分润湿后，其pH值应在7.0～7.4范围内。（5）纸片和内包装聚丙烯塑膜袋应无菌，加入相应水量的无菌水，37℃±1℃培养24h后，纸片应无微生物生长，其紫色保持不变，且无红斑出现。（6）按7.4.2中的方法进行总大肠菌群和粪大肠菌群阴性、阳性标准菌株检验，其特性应符合要求。4.2无菌水用新制备的去离子水或蒸馏水，按无菌操作要求，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。4.3硫代硫酸钠溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml称取硫代硫酸钠10g，溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100ml，现配。4.4乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15g/ml称取EDTA-Na215g，溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100ml，此溶液保质期为30d。5仪器和设备5.1恒温培养箱：37℃±1℃。5.2恒温培养箱：44.5℃±0.5℃。5.3高压蒸汽灭菌器：121℃、101.3kpa。5.4冰箱：0～4℃。5.5移液管：1±0.01ml、10±0.1ml。5.6试管：ø15mm×150mm。5.7采样瓶：250ml。注1：移液管、试管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌20min，烘干，备用。6样品6.1样品采集与其他项目一同采样时，先单独采集微生物样品，采样瓶不得用水样洗涤，按无菌操作的要求采集水样约200ml于灭菌的采样瓶中。纸片不加水纸片加水3采集江、河、湖、库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面10～15cm处，瓶口朝水流方向，拔玻塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水的龙头，采水前将龙头打开至最大，放水3～5min；然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌，开足龙头，再放水1min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。6.2样品保存采样后2h内检测，否则，需10℃以下冷藏并不得超过6h。实验室接样后，不能立即开展检测的，应将样品放入0～4℃冰箱并2h内测定。6.3干扰和消除如果采集的是含有余氯或经过加氯处理的水样，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3）0.2ml；如果采集的是重金属离子含量较高的水样，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（4.4）0.6ml，以消除干扰。加入干扰消除剂的采样瓶121℃高压蒸汽灭菌20min，采样瓶外壁及包扎纸干燥后可用于样品采集。酸性样品，需在分析前按无菌操作要求调节样品的pH值至7.0～8.0。注2：10mg硫代硫酸钠可保证去除水样中1.5mg余氯，硫代硫酸钠用量可根据水样实际余氯量调整。7分析步骤以下步骤均在无菌操作的条件下进行。7.1接种水样的准备当每张纸片接种水样量为10ml或1ml时，充分混匀水样备用即可。当每张纸片接种水样量小于1ml时，水样应制成稀释样品后使用。接种量为0.1ml、0.01ml时，分别制成1:10稀释样品、1:100稀释样品。其他接种量的稀释样品依次类推。1:10稀释样品的制作方法为：吸取1ml水样，注入盛有9ml无菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。其他稀释度的稀释样品同法制作。7.2水样接种7.2.1接种量每个样品按三个10倍递减的不同接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，共接种15张纸片。根据水样的污染程度确定接种量，应尽可能使5个接种量最大的纸片为阳性、5个接种量最小的纸片为阴性，避免出现所有三个不同接种量共15张纸片全部为阳性或者全部为阴性。清洁水样的参考接种量分别为10ml、1ml、0.1ml，受污染水样参考接种量根据污染程度可接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.