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DBDBDBDB上海市地方标准DDDDBBBB31/2010—2012上海市食品药品监督管理局发布2012-10-26发布2012-10-26实施食品安全地方标准火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定液相色谱-串联质谱法DB31/2010—2012I前言本标准的附录A、附录B为资料性附录。DB31/2010—20121食品安全地方标准火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于火锅酱料、汤料、调味油和固体类调味粉等火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因的测定。2原理样品用水或盐酸溶液分散均匀、乙腈提取后，经盐析分层，乙腈提取液用键合硅固相萃取吸附剂净化，离心，液相色谱－串联质谱仪检测，罂粟碱、那可丁和蒂巴因采用外标法定量，吗啡和可待因采用内标法定量。3试剂与材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。3.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。3.4盐酸（HCl）。3.5甲酸铵（HCOONH4）。3.6氢氧化钠（NaOH）。3.7无水硫酸镁（MgSO4）：研磨后在500℃马弗炉内烘5h，200℃时取出装瓶，贮于干燥器中，冷却后备用。3.8无水醋酸钠（CH3COONa）。3.9乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）填料：粒度40～70μm。3.10C18填料：粒度40～50μm。3.11盐酸溶液（0.1mol/L）：量取盐酸（3.4）9mL，加水至1L，摇匀备用。3.12甲酸铵溶液（10mmol/L）：准确称取1.26g甲酸铵（3.5）溶解于适量水中，定容至2L，混匀后备用。3.13甲酸甲醇溶液（0.5％）：量取甲酸（3.3）1mL，置于200mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀备用。3.14氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称取40g氢氧化钠（3.6）溶解于适量水中，定容至1L，混匀后备用。3.15盐酸罂粟碱、吗啡、那可丁、磷酸可待因和蒂巴因标准品：纯度不少于98％。3.16内标物质：吗啡-D3，可待因-D3。DB31/2010—201223.17标准储备液（1.0mg/mL）：精密称取盐酸罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和磷酸可待因标准品适量，用甲酸－甲醇溶液（3.13）配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的浓度均为1.0mg/mL的溶液，作为标准储备液。4℃避光保存，有效期三个月。3.18混合标准品溶液：精密吸取浓度为1.0mg/mL的罂粟碱、那可丁、蒂巴因储备液各1.0mL和浓度为1.0mg/mL的吗啡、可待因储备溶液各5mL于20mL容量瓶中，用乙腈（3.2）定容至刻度，摇匀，即得含罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为50µg/mL和吗啡、可待因浓度为250µg/mL的混合标准品溶液。4℃避光保存，有效期三个月。3.19同位素内标工作溶液（5.0μg/mL）：分别精密吸取内标物质（3.16）适量，用甲醇（3.1）配制成吗啡-D3，可待因-D3的浓度均为5.0μg/mL的溶液。4℃避光保存，有效期三个月。3.20标准工作溶液的配制：分别精密吸取上述混合标准品溶液（3.18）和同位素内标工作溶液（3.19）适量，用乙腈（3.2）稀释成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL，吗啡、可待因浓度为5.0ng/mL、10.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、250ng/mL的系列标准工作溶液，内标溶液浓度均为50.0ng/mL。临用新配。3.21甲酸乙腈溶液（0.1％）：量取甲酸（3.3）1mL，加乙腈（3.2）稀释至1L，摇匀，过滤。3.22甲酸甲酸铵溶液（0.1％）：量取甲酸（3.3）1mL，加甲酸铵溶液（3.12）稀释至1L，摇匀，过滤。3.23滤膜：0.22μm（尼龙）。3.24pH试纸：pH1～14。4仪器和设备4.1液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源（ESI）。4.2分析天平：感量为0.00001g和0.01g。4.3离心机：≥10000转/分钟。4.4超声波清洗器。4.5涡旋混合器。5分析步骤5.1提取5.1.1火锅酱料、汤料、调味油称取2g试样（精确至0.01g）于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入150µL同位素内标工作液（3.19），再加入5mL水，振摇使分散均匀（酱类样品必要时可加10mL水），加入15mL乙腈（3.2），涡旋振荡1min，加入6g无水硫酸镁（3.7）和1.5g无水醋酸钠（3.8）的混合粉末（或以相当的市售商品代替），迅速振摇，涡旋振荡1min，以4000转/分钟离心5min，取上清液待净化。5.1.2固体类调味粉称取2g试样（精确至0.01g）于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入150µL同位素内标工作液（3.19），再加入5mL盐酸溶液（3.11）溶液，超声处理30分钟，用氢氧化钠溶液调节pH值呈中性，加入15mL乙腈（3.2），涡旋振荡1min，加入6g无水硫酸镁（3.7）和1.5g无水醋酸钠（3.8）的混合粉末（或以相当的市售商品代替），迅速振摇，涡旋振荡1min，以4000转/分钟离心5min，取上清液待净化。5.2净化称取50mg（±5mg）PSA（3.9），100mg（±5mg）无水硫酸镁（3.7），100mg（±5mg）C18粉末DB31/2010—20123（3.10）置于2mL聚四氟乙烯具塞离心管中(或以相当的市售商品代替），移取1.5mL上清液（5.1）至此离心管中，涡旋混合1min，以10000转/分钟离心2min，移取上清液，0.22μm滤膜（3.23）过滤，取滤液待测。6测定6.1参考液相色谱条件a)色谱柱：BEHHILIC（粒径1.7µm，2.1×100mm），或相当者；b)进样量：5μL；c)柱温：40℃；d)流速：0.3mL/min；e）流动相：A相（3.21）：含0.1%甲酸的乙腈，B相（3.22）：含0.1%甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液，按表1进行梯度洗脱。表1梯度洗脱程序时间/minA相/%B相/%0.0090100.3090101.0080202.5080203.0090106.0090106.2参考质谱条件a)离子化方式：电喷雾电离；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件见附录A。6.3定性测定在相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分色谱峰的保留时间一致，样品溶液的定性离子相对丰度比与浓度相当标准溶液的定性离子相对丰度比进行比较时，相对偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在该组分。表2定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%＞5020～5010～2010允许的相对偏差/%±20±25±30±506.4定量测定DB31/2010—20124在仪器最佳状态下，对标准工作液进样，以罂粟碱、那可丁和蒂巴因的色谱峰面积为纵坐标，罂粟碱、那可丁和蒂巴因的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，外标法定量；以吗啡和可待因的峰面积与相应内标物峰面积的比值为纵坐标，吗啡和可待因的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，内标法定量。在上述色谱和质谱条件下，7种化合物的标准物质提取离子（定量）质谱图参见附录B。6.5空白试验除不称取样品外，按5.1、5.2步骤进行后测定。7分析结果的表述样品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴的含量按下式计算：错误！未找到引用源。…………………………………………………………………(1)式中：X—试样中各待测物的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；c—从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为微克每升（µg/L）；V—样液的提取体积，此处为15，单位为毫升（mL）；m—试样的质量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。8方法精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20％。9方法检出限和定量限本标准罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的检出限分别为8μg/kg、40μg/kg、8μg/kg、40μg/kg、8μg/kg。定量限分别为25μg/kg、125μg/kg、25μg/kg、125μg/kg、25μg/kg。10方法准确度罂粟碱、那可丁和蒂巴因添加浓度范围为25μg/kg～250μg/kg，吗啡、可待因添加浓度范围为125μg/kg～1250μg/kg时，回收率为70％～110％。DB31/2010—20125附录A质谱/质谱测定参考条件5种生物碱及2个内标化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）及碰撞气能量（CE）见表A.1。表A.17种化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量组分名称定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）去簇电压（DP）/V碰撞气能量（CE）/eV罂粟碱340.4/202.2340.4/202.29238340.4/171.149吗啡286.0/181.3286.0/181.39750286.0/165.350那可丁414.4/220.5414.4/220.59530414.4/353.334可待因300.4/215.2300.4/215.29034300.4/165.455蒂巴因312.3/58.3312.3/58.35238312.3/249.122吗啡-D3289.4/185.2289.4/185.29540289.4/165.253可待因-D3303.5/215.3303.5/215.38035303.5/165.260DB31/2010—20126附录B7种化合物标准物质的提取离子（定量）质谱图图B.17种化合物标准物质的提取离子（定量）质谱图（罂粟碱：20ng/mL、吗啡：100ng/mL、那可丁：20ng/mL、可待因：100ng/mL、蒂巴因：20ng/mL、吗啡-D3：50ng/mL、可待因-D3：50ng/mL）罂粟碱m/z340.4/202.2吗啡m/z286.0/181.3那可丁m/z414.4/220.5可待因m/z300.4/215.2蒂巴因m/z312.3/58.3吗啡-D3m/z289.4/185.2可待因-D3m/z303.5/215.32.042.651.812.622.402.662.61