扫描电镜原理及操作

2015/6/201扫描电子显微镜基本原理及使用技术赵岩上海海洋大学水产与生命学院一、扫描电子显微镜的原理和结构1、成像原理2、扫描电镜的结构3、扫描电镜的特点4、电子与样品的相互作用二、扫描电子显微镜的实践1、扫描电子显微镜的一般操作2、扫描电子显微镜图像的缺陷3、观察条件的确定扫描电子显微镜基本原理及使用技术昆虫学研究中的应用不同倍率的果蝇SEM像扫描电镜的基本原理：利用极狭窄的电子束去扫描样品，即电子束在样品上作光栅运动。电子束与样品作用将会产生各种效应，主要是样品的二次电子发射。。二次电子会产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时建立起来的。即：使用逐点成像的方法获得放大的像。1、扫描电子显微镜的结构和原理二次电子的发射是由于入射电子碰撞样品的核外电子，核外电子获得能量脱离原子而成为二次电子。二次电子只产生于入射电子的散射区域，这个散射区域呈“泪滴”状。二次电子的产生2015/6/202二次电子的产生额（产生数量）随入射角的变化而变化。对于给定的电子束，二次电子发射率主要取决于电子束的入射角：η为二次电子发射率；θ为电子束入射角。cos1二次电子的产生当样品表面是凹凸不平时，入射角不断改变，二次电子的产生额也随之而变化，二次电子像的亮度也随着样品的表面形貌而变化。二次电子像能反映样品表面的形貌：实际像与日常照片中的负片相似。二次电子所形成的像（二次电子像）：反映了样品表面的形貌。二次电子像每一点的相对亮度：取决于样品对应点的二次电子发射率，每点的二次电子发射率：取决于电子束加速电压，束流，电子束的入射角（即入射束与样品表面法线间的夹角）和样品原子序数。小结扫描电镜二次电子像的放大倍率：由屏上图像的大小与电子束在样品上扫描区域的大小的比例决定：扫描区域的大小像的大小屏上图像的倍率）（M小结扫描电镜像的分辨本领：取决于一些因素，其中最主要的是：1、电子束斑的直径。2、电子枪亮度，样品的性质，相互作用的方式以及扫描速度和像的线数。目前商品扫描电镜分辨率一般达到50-60埃，使用场发射电子枪可达约10埃。小结显微镜成像原理2、扫描电镜的结构2015/6/203扫描电镜的主要由三大部分组成：1、电子光学系统2、成像系统3、真空系统2、扫描电镜的结构（一）电子光学系统:可称为镜筒，它的外观与透射电镜的镜筒相似，实际上相当于透射电镜的照明系统(它不需要成像系统)，它是由：电子枪、几个磁透镜、扫描线圈以及样品室组成。2、扫描电镜的结构扫描电镜的电子枪与透射电镜的电子枪基本相同，加速电压较低，一般在40kV以下。磁透镜一般有三个：第一、二聚光镜和物镜，作用与透射电镜的聚光镜相同:缩小电子束的直径，把来自电子枪的约30微米大小的电子束经过第一、二聚光镜和物镜的作用，缩小成直径约为几十埃的狭窄电子束。2、扫描电镜的结构物镜装备：有可动光栏；消散器、带有扫描电路的偏转线圈；其中偏转线圈通以锯齿波的电流，产生的磁场作用于电子束使它在样品上扫描。扫描的区域、扫描比率和每厘米的扫描线数都可以选择。2、扫描电镜的结构带有扫描电路的偏转线圈同时输送锯齿波电流给显示部分的显像管（CRT）的偏转线圈，镜筒的电子束与显像管的电子束严格同步。2015/6/2042、扫描电镜的结构（二）扫描电镜的真空系统由机械泵、扩散泵、检测系统、管道及阀门等组成。样品室位于镜筒的底部，样品放于样品台上，样品台带有使样品移动（前后，左右，上下）、倾斜和旋转的控制杆。与透射电镜同样的理由，镜筒也是被真空系统排气至高真空，一般为10-5乇真空度。与透射电镜一样，扫描电镜的镜简也有一套合轴调整装置，相对比较简单。2、扫描电镜的结构2、扫描电镜的结构真空系统安装部位（三）成像系统：包括信号的收集、放大、处理、显示与记录部分。信号的收集器：用于把闪烁片产生的光信号送到它后面的光电倍增管。在光电倍增管的后面是前置放大器和视频放大器，最后接到显像管的栅极。2、扫描电镜的结构信号的收集器部分2、扫描电镜的结构显示和记录部分：2、扫描电镜的结构样品上被扫描的区域与显像管的屏是点点对应的。在样品上任何一点上的二次电子发射的强度的任何变化将表现为在屏上对应点的亮度的变化。用这种方法就如电视机屏上的像一样，一点一点，一线一线地组成了像。这个像可以在观察显像管的屏上观察，也可以把照相显像管屏上的像拍摄记录下来。2015/6/2052、扫描电镜的结构显示单元光电倍增管扫描电镜的镜简两个显像管和照相机一系列的电路以及相应的调节旋钮为了完成聚散、消散以及放大率，视野和加速电压的选择以及反差与亮度的调节，需要一系列的电路以及相应的调节旋钮。场扫描电镜的技术指标3、扫描电子显微镜的特点一、扫描电子显微镜的结构和原理具有一些极有价值的特点：(1)能在很大的放大倍数范围工作——从几倍到几十万倍，相当于从放大镜到透射电镜的放大范围。以致使用者可以首先概观整个样品，如昆虫、植物种子等，然后迅速转换到观察某些选择的结构的细节，给观察带来很大的方便。3、扫描电子显微镜的特点(2)扫描电镜具有很大的焦深——300倍于光学显微镜。在放大倍数是500倍时，焦深可达1000微米。对于复杂而粗糙的样品表面，仍然可得清晰聚焦的图像。并且图像立体感强，易于分析。（图）(3)扫描电镜的操作十分简单——样品与终像之间没有透镜。3、扫描电子显微镜的特点2015/6/2063、扫描电子显微镜的特点有强烈的立体视觉大鳞副泥鳅的受精过程示受精孔精孔区卵膜孔受精后5秒有强烈的立体视觉:受精后10秒受精后3分钟受精后10分钟大鳞副泥鳅的受精过程有强烈的立体视觉:(4)样品制备较简单——甚至可以不作任何处理。并且样品可以很大，如直径可达10厘米以上。（图）(5)无损分析——在观察样品表面形貌的同时又可对样品进行微区成分的无损分析。3、扫描电子显微镜的特点3、扫描电子显微镜的特点有超大的样品区获得高分辨率的代价是仪器复杂，样品制备复杂，要获得三维信息较困难等，而扫描电镜对研究样品表面的形貌是理想的，但却不易获得内部结构的信息。它的分辨率虽然对不少工作是足够的，但却比不上透射电镜。透射和扫描电镜在性能上有许多方面是相互补充，缺一不可。3、扫描电子显微镜的特点2015/6/2074、电子与样品的相互作用（一）：电子：1、二次电子2、背散射电子（反射电子）3、俄歇电子4、透射电子5、吸收电子4、电子与样品的相互作用（二）射线1、X射线、2、阴极荧光电子与样品的相互作用会产生多种的信息，基本上分成两大类：一是电子，二是射线。用二次电子形成的二次电子像反映了样品表面的形貌，它的高分辨率，是扫描电镜主要的用途。（一）电子：1、二次电子它是样品本身的原子中的外层电子，被入射电子激发出来后，形成带有样品的形貌和成分等信息的电子束。二次电子主要反映样品浅表层（约5-50nm）的信息。它在扫描电镜成像过程中担任主角。4、电子与样品的相互作用2、背散射电子：又称背反射电子，是被样品大角度反射回来的入射电子，它主要反映样品内部较深层（约50—100nm）原子的质量信息。用背散电子获得的图像有两种情况：（1）反映样品表面的形貌，与二次电子像相似。（2）反映样品的密度和原子序数。利用这种特性，可以将生物组织中各种细胞用重金属染色，再把它检测出来。3、电子与样品的相互作用3、俄歇电子是一种具有特征能量值的电子，这种电子1925年发现，用它可以进行样品轻元素的分析，3、电子与样品的相互作用（二）射线1、X射线：又称伦琴射线；波长约0.001-10nm。电子探针轰击样品时，可产生特征X射线和连续X射线。其中特征X射线的波长和能量随样品中各种元素的不同而各异，根据这一性质可以对样品中的某些元素进行定性和定量分析。X射线主要反映样品深层（约50—500nm）的某些信息。X射线适合于重元素的成分分析。3、电子与样品的相互作用2015/6/2082、阴极荧光：入射电子与样品相互作用而发射出可见光或红外光、紫外光的现象。阴极荧光具有一种电子束激发的光谱，和原子里面层状结构有关。若将荧光光谱进行分光分析，可用来鉴别主体物质和分析杂质含量。3、电子与样品的相互作用二、扫描电子显微镜的操作第四部分:扫描电镜正确操作的目的是为了获得高质量的照片。高质量的照片应满足以下要求：(1)分辨率高。(2)视野选择好。(3)景深大，立体感强。(4)图像层次丰富。即要求反差与亮度适当。要获得高质量的照片就要求正确的操作和正确选择观察条件。二、扫描电子显微镜的操作操作步骤：(1)启动电镜。包括接通电源，开动真空系统进行排气，在真空度达到要求后，接通显示单元电源。(2)放入样品，注意调节样品高度。二、扫描电子显微镜的操作(3)设定观察条件。这些条件包括：加速电压、束电流、光阑直径、工作距离、放大倍率以及倾斜角等。(4)聚焦，消散。注意选择好视野。(5)照相摄影。根据底片特性选择合适的反差，亮度及拍摄时间。(6)停机。关掉电源和冷却水。二、扫描电子显微镜的操作观察条件的设定包括：加速电压、束电流、光栏直径、工作距离、放大倍率以及倾斜角等见图例2015/6/209操作中几个带有普遍性问题：(1)合轴：与透射电镜一样扫描电镜也应良好地合轴。合轴不良将引起像差使分辨率下降，而且会使讯号减弱，降低信噪比使图像质量变差。物镜光栏不合轴使像散无法消除，从而降低分辨率。在操作中如发现聚焦过程图像移动，有可能是物镜光栏不对中，此时像散无法彻底消除。二、扫描电子显微镜的操作(2)聚焦和消散（消除像散）：消散和聚焦是需要熟练掌握的操作，稍有不慎图像质量明显下降，两者是交替同时进行的。方法如下：首先放大倍数放在10000倍以上，先调粗聚焦，然后在焦点附近反复做稍欠焦、正焦、过焦的操作。二、扫描电子显微镜的操作如果存在像散，在欠焦和过焦时，象被拉长，而且欠焦与过焦时拉长方向是垂直的。二、扫描电子显微镜的操作选择stigmaalign（xy）通过操作面板上的xy旋钮调整至图像至心脏式跳动而不是摇摆晃动，同样方法调整stigmaaligny二、扫描电子显微镜的操作(3)反差和亮度的调整：如果图像的反差与亮度调整不当，层次少，会使图像中细节掉失。反差调整：依靠改变光电倍增管的电压（300-600V）来进行。亮度调整：改变信号的直流成分来调节。二、扫描电子显微镜的操作调整注意点：一般来说，增加反差也增加了直流成分，因而亮度水平也会增高，所以调节反差要和调节亮度水平须同时进行。振幅的强度显示图像反差，直流成分(高低)显示图象的亮度，过高或过低的反差或亮度，图像细节会损失。二、扫描电子显微镜的操作2015/6/2010在拍摄时应根据底片的型号和特性来调整反差和亮度，而图像的反差大小与亮度水平，由曲线的振幅和高低来确定。二、扫描电子显微镜的操作