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福建省地方标准DB35/T896—2009食品中碱性桃红T含量的测定液相色谱-荧光检测法2009-03-11发布2009-04-01实施DB35福建省质量技术监督局发布食品伙伴网—2009I前言本标准的附录A为资料性附录。本标准由福建省质量技术监督局提出并归口本标准由福建省质量技术监督局批准。本标准起草单位：福建省中心检验所。本标准主要起草人：郑小严、何树坤、陈永煊、林钦、戴明、黄永辉、谢勇。本标准系首次发布。食品伙伴网—20091食品中碱性桃红T含量的测定液相色谱-荧光检测法1范围本标准规定了高效液相色谱荧光检测法测定食品中碱性桃红T含量的方法。本标准适用于蜜饯、水产品、豆制品、食用菌、炒货、坚果和固体调味品食品中碱性桃红T含量的测定。本标准碱性桃红T检出限为：0.004mg/kg。本标准碱性桃红T定量限为：0.02mg/kg2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品通过碱化甲醇提取、二氯甲烷萃取、正己烷净化，高效液相色谱荧光检测器检测食品中碱性桃红T含量，外标法定量。4试剂和材料4.1除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2甲醇：色谱纯。4.3甲酸：优级纯。4.4氨水：优级纯，含量为25%。4.5磷酸：优级纯。4.6氯化钠。4.7二氯甲烷。4.8无水硫酸钠：650℃灼烧4h，在干燥器内冷却到室温，贮于密封瓶中备用。4.9碱化甲醇：500mL甲醇（4.2）+10mL氨水（4.4）。4.10酸化甲醇：500mL甲醇（4.2）+10mL甲酸（4.3）。4.11甲醇饱和正己烷：正己烷加入少量甲醇，直致分层出现。4.122%氨水（体积百分比）：取2mL氨水（3.2.4）用纯水稀释到100mL。4.130.05%磷酸（体积百分比）：取0.5mL磷酸（4.5）用纯水稀释到1000mL。4.14碱性桃红T标准品（SafranineT，Cas477-73-6，C20H19N4Cl，分子量350.84，纯度≥99%）。4.15碱性桃红T标准储备溶液：准确称取20.0mg碱性桃红T标准品，用甲醇溶解定容到100mL,配制成200µg/mL的标准储备液。4℃冰箱放置，3个月内使用。4.16碱性桃红T标准使用溶液：准确移取适量标准储备液（4.15），用酸化甲醇（4.10）稀释成0.05µg/mL～1µg/mL的标准系列。4℃冰箱放置，一周内使用。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。5.2高速万能粉碎机。5.3涡旋混合器。食品伙伴网—200925.4氮气吹干仪。5.5水循环真空泵。5.6旋转蒸发仪。5.7超声波发生器（40KHz/600W）。5.8冷冻高速离心机：15000r/min。5.9分析天平（感量0.0001g和0.1g）。5.10高速匀浆机。6试样制备和保存取有代表性样品500g，用粉碎机或匀浆机粉碎，混匀，分成2份，装入洁净容器内，密封并标识。7分析步骤7.1试样的提取净化称取5g（精确到1mg）试样，置于50mL离心管中，准确加入20.0mL碱化甲醇（4.9），超声提取30min；于4℃，15000r/min离心5分钟，移取5.0mL上清液于50mL离心管中，再加入10mL2%氨水（4.12）和2g氯化钠（4.6）混匀，加入二氯甲烷（4.7）涡旋萃取3次，每次10mL；于4℃，15000r/min离心5分钟，吸出下层萃取液合并，过无水硫酸钠（4.8）滤入250mL浓缩瓶中，40℃，真空旋转蒸发至约剩1mL，用二氯甲烷转入10mL刻度试管中，40℃氮气吹近干，加入3mL酸化甲醇（4.10）溶解残渣，用甲醇饱和正己烷（4.11）萃取净化3次，每次2mL，吸出正己烷层弃去，40℃氮气吹至2mL以下，用酸化甲醇（4.10）定容到2.0mL，混匀，用0.2μm滤膜过滤后检测。7.2高效液相色谱条件a）色谱柱：C18，5μm，4.6×150mm（内径）或相当者；b）柱温：30℃；c）荧光检测波长：激发波长为271nm，发射波长为572nm；d）进样量：20μL；e）流动相0.05%磷酸（4.10）与甲醇（4.2）梯度见表1。表1流动相及梯度表时间（min）流速（mL/min）甲醇（%）0.05%磷酸（%）曲线012575/8150506151257511201257511（本方法条件为参考条件，可根据不同仪器、色谱柱进行调整。）7.2定量测定外标法定量：以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，碱性桃红T色谱图见附录A中图A。8结果8.1计算试样中碱性桃红T的含量按式（1）计算：食品伙伴网—20093mVcX×=×k…………………………（1）式中：X——试样中碱性桃红T的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c——试样溶液中碱性桃红T的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V——试样提取液体积，单位为毫升（mL）；m——试样的质量，单位为克（g）；k——稀释因子。结果保留2位有效数值。8.2重复性在重复性条件下，获得的碱性桃红T的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%。食品伙伴网—20094DB35/T896－2009附录A（资料性附录）液相色谱图--碱性桃红T图A.样品加标碱性桃红T液相色谱图福建省地方标准食品中碱性桃红T含量的测定液相色谱-荧光检测法DB35/T896—2009*2009年3月第一版2009年4月第一次印刷食品伙伴网