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ICSDB34备案号：安徽省地方标准DB34/T817—2008饲料中己烯雌酚的测定——酶联免疫吸附法2008-08-01发布2008-08-01实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T817—2008I前言本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省质量技术监督局批准。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽省畜产品质量安全检测中心。本标准起草人：许世富、汤春莲、刘发全、钱志平。本标准于2008年8月1日首次发布。DB34/T817—20081饲料中己烯雌酚的测定——酶联免疫吸附法1范围本标准规定了饲料中己烯雌酚检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于饲料中己烯雌酚的含量快速测定。本方法在配合饲料中的检测限为10μg/kg，在预混/浓缩饲料中的检测限为20μg/kg，线性范围：0.005ng～0.405ng。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3试样制备配合料、浓缩料、预混料等饲料产品，按GB/T14699.1规定，选取有代表性样品200g～500g，用四分法缩至100g，粉碎通过0.45mm孔径筛，充分混匀，贮于磨口瓶中备用。4原理饲料中己烯雌酚经乙腈提取，氮气吹干，用氯仿溶解后用于酶联免疫测定。测定方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：吸附在孔内的己烯雌酚与标准或样品中的己烯雌酚竞争性地与己烯雌酚抗体相结合，与标准品或样品相结合的己烯雌酚抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，其再与加入的酶标记的第二抗体相结合，酶底物在酶作用下产生发色物，在一定浓度范围内吸光度的高低与样品中己烯雌酚的含量成反比。5试剂和溶液5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级水的规定。5.2竞争酶标免疫法己烯雌酚试剂盒，2℃～8℃冰箱中保存。5.2.1微孔板：包被有己烯雌酚抗体。5.2.2己烯雌酚标准溶液：浓度范围0.01μg/L～8.1μg/L。5.2.3酶标记物。5.2.4己烯雌酚抗体浓缩液。5.2.5底物A。5.2.6底物B。5.2.7终止液。5.2.8浓缩洗涤液。5.2.9浓缩复溶液。5.3洗涤液：用水20倍稀释厂商提供的浓缩洗涤液。DB34/T817—200825.4复溶液：用水2倍稀释厂商提供的浓缩复溶液。5.5乙腈。5.6氯仿。5.7氢氧化钠。5.8磷酸。5.9氢氧化钠溶液（1.0mol/L）：称取4.0g氢氧化钠加水溶解后稀释到100mL。5.10磷酸溶液：量取磷酸100mL加水150mL，混匀。6仪器设备6.1酶标仪（带450nm滤光片）。6.2振荡器。6.3冷冻离心机。6.4样品粉碎机。6.5氮吹仪。6.6分析天平：感量0.01g。6.7微量加样器及配套吸头：（单道20μL，50μL，100μL。多道50μL～300μL）。7测定步骤7.1样品处理7.1.1称取2±0.1g粉碎后的饲料样品，加8mL乙腈，振摇10min，4℃条件下3000g离心5min。取2mL上清液，60℃氮气吹干。加0.5mL氯仿，涡动20s，加2mL氢氧化钠溶液（5.9），涡动30s，4℃条件下3000g离心5min。取1mL上清液，加入100μL磷酸溶液（5.10），涡动5s。7.1.2按如下方法稀释进行检测：配合料：取50μL，加入950μL稀释后的复溶液，涡动混匀，取50μL进行检测，总稀释倍数为100倍；浓缩、预混料：取25μL，加入975μL稀释后的复溶液，涡动混匀，取50mL进行检测，总稀释倍数为200倍。7.2测试程序7.2.1测定在室温20℃～25℃条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20℃～25℃）下放置1h～2h。7.2.2将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。7.2.3分别在各孔中加50µL的标准品溶液或样品溶液，再加50µL抗体，轻轻晃动反应板，37℃反应30min。7.2.4倾出微孔中的液体，在所有微孔中加洗涤液250µL，轻轻晃动反应板，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板4遍。7.2.5每孔加100µL酶标记物，37℃反应30min。7.2.6倾出微孔中的液体，加250µL洗涤液，轻轻晃动反应板，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板4遍。7.2.7每孔加50µL底物A，再加50µL底物B，轻轻晃动反应板，37℃避光反应15min。7.2.8每孔加50µL终止液，轻轻晃动反应板，30min内在450nm下检测吸光度。8结果判定和表述按下式计算百分吸光度值：百分吸光度值=0BB×100％…………………………………………………（1）DB34/T817—20083式中：B——为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；Bo——为零标准的标准溶液平均吸光度值。用专业计算机软件求出供试样品中己烯雌酚的浓度，乘以稀释系数即得检测结果。或计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度（ng/L）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在100ng/L～8100ng/L范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/L）可以从校正曲线上读出。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法在配合饲料中的检测限为10μg/kg，在预混、浓缩饲料中的检测限为20μg/kg。9.2准确度本方法在配合饲料中20μg/kg（预混、浓缩饲料中40μg/kg）添加浓度水平上的回收率为80％～120％。9.3精密度本方法的批内变异系数CV％≤10％，批间变异系数CV％≤15％。10其他10.1配合饲料稀释系数为100，浓缩料/预混料稀释系数为200。10.2本方法为快速测定法，检测结果配合饲料检测结果小于10μg/kg时可判为未检出，大于10μg/kg时需用液相色谱法（HPLC）确认，预混/浓缩饲料检测结果小于20μg/kg时可判为未检出，大于20μg/kg时需用液相色谱法（HPLC）确认。10.3B0吸光值应该不低于0.8。10.4试剂盒可能存在交叉反应，不同品牌的试剂盒，其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。