db34 t 802-2008 液态菌种生产技术规程

ICSDB34备案号：安徽省地方标准DB34/T802—2008液态菌种生产技术规程2008-06-25发布2008-06-25实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T802—2008I目次前言.................................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13术语和定义..........................................................................14技术要求............................................................................15液体菌种生产技术规程................................................................26液体菌种的使用方法..................................................................47标签、贮存..........................................................................4附录A（规范性附录）常用母种培养基...................................................5附录B（规范性附录）常用摇瓶种培养基.................................................5DB34/T802—2008II前言本标准由由安徽省农业委员会和安徽大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准由安徽大学生命科学学院、安徽省菜篮子工程办公室、安徽省食用菌技术协会、六安市金土地农业科普示范园起草。本标准主要起草人：张书祥、沈业寿、丁作坤、陈全勇、史新强。本标准于2008年6月25日首次发布。DB34/T802—20081液态菌种生产技术规程1范围本标准规定了液态菌种的生产场地、设备设施、工艺流程、生产技术规程、使用方法以及标签、贮存。本规程适用于主要栽培的食用菌液态菌种。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB5749生活饮用水卫生标准GB9687-1988食品包装用聚乙烯成型品卫生标准GB9688-1988食品包装用聚丙烯成型品卫生标准3术语和定义3.1液态菌种liquidspawn液态菌种是以菌种所存活的培养基形态来命名的，液态菌种是指在装有液体培养基的容器中，通过不断通气搅拌或振荡，使菌丝在液体深层繁育，并在短期内获得大量菌丝体（球）和代谢产物。概括来说，就是生长在液体培养基中的菌种。3.2母种stockculture由孢子、子实体组织、菇木或基质菌丝分离纯化，并在琼脂培养基上繁殖的菌种。3.3发酵罐种子fermentorstrain由摇瓶菌种转接，在发酵罐中扩大培养得到的菌种。3.4接种innoculation将菌种移植到新鲜培养基物中的方法。3.5灭菌sterilization用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。4技术要求4.1技术人员具有与所生产的菌种级别相适应的《食用菌菌种生产经营许可证》的专业技术人员。4.2生产场地选择4.2.1基本要求DB34/T802—20082地势干燥、空气优良、通风良好、水源充足且符合GB5749生活饮用水卫生标准、排水畅通、交通便利。4.2.2环境卫生要求至少300m之内无禽畜舍，无垃圾场，无污水、粉尘污染源。4.3厂房设置和布局厂房设置具有相互隔离的原料库、配料场、灭菌室、无菌室、培养室、化验室、储藏室。4.3.1原料库干燥、通风良好，防雨防潮，远离火源。4.3.2配料场水电方便，空间充足，通风良好，采光良好。4.3.3灭菌室电力充足，水源方便，通风良好，水电布局合理，便于操作。4.3.4冷却室洁净、防尘、易通风散热。4.3.5无菌室要设缓冲间，换气性能优良，具无菌装备，有调温设施。4.3.6培养室内壁和房顶光滑，易清洗和消毒，在室内直接进行菌种培育时，室墙壁要加隔温层，利于控温。有调温设施。4.3.7发酵室电力充足，水源方便，空间充足，通风良好、地面易冲洗，排水方便。4.3.8检验室水电方便，空间充足，有利于安装、放置检验设备和仪器。4.4设备设施具天平、高压灭菌锅、恒温培养箱、鼓风干燥箱、摇床、超净工作台、显微镜等，高压灭菌锅应选用经有关部门检验的安全合格产品。小型发酵罐罐体、管道用不锈钢SUS316L材质。空压机选无油低噪音型。5液体菌种生产技术规程5.1工艺流程母种→活化→摇瓶菌种↓原料→培养基配制→空消后发酵罐→实罐灭菌→发酵培养（两级）→液体菌种↑无菌空气5.2母种5.2.1容器使用18mm×180mm或20mm×200mm玻璃试管，试管应保持清洁、干燥。5.2.2培养基根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。常用的配方见附录A。5.2.3灭菌高压蒸气灭菌，在121℃，0.11MPa的压力下，维持在40分钟。灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。5.2.4接种DB34/T802—20083用药物消毒并用紫外灯照射接种室和超净工作台，在超净工作台上严格按无菌操作接种。接种完成后及时贴好标签。5.3摇瓶种5.3.1容器采用500ml的常规三角瓶，三角瓶应保持清洁、干燥。5.3.2装液量每瓶装量为100～150ml，用纱布和牛皮纸封口。5.3.3培养基根据不同微生物的不同营养需要配制不同的摇瓶培养基。常用的配方见附录B。5.3.4灭菌同5.2.3高压蒸汽灭菌法。5.3.5接种将灭菌后的培养基冷却至30℃以下进行接种，每瓶接入0.5cm2左右大小的琼脂斜面母种3块～5块。5.3.6培养将接种后的三角瓶放到摇床上进行振荡培养，振荡频率为100r/min～120r/min，振幅为6cm~10cm。若使用旋转式摇床，振荡频率为150r/min~220r/min，旋转速度不宜过快。摇床适温应控制在24℃~26℃。5.4种子罐种5.4.1容器气升式不锈钢发酵罐，体积根据生产规模自定。5.4.2装液量定容至罐体积的70%。5.4.3培养基同5.3.3培养基5.4.4灭菌实消，先用夹层预热培养基至80℃后，从不同方向放蒸汽进罐升温至121℃，0.11MPa保压恒温40min，关蒸汽，无菌空气保压，开冷却水降温，待接种。5.4.5接种接摇瓶种子，接种量为7％～10％。接种后调节进、排气阀，使罐内保持一定正压即可。5.4.6培养发酵培养温度，pH值根据不同微生物进行控制。定时用肉汤培养基检查发酵液的无菌情况，显微镜检查菌体的状况。5.5发酵罐种5.5.1容器气升式的不锈钢发酵罐，体积根据生产规模自定。5.5.2装液量定容至罐体积的70%。5.5.3培养基同5.3.3培养基5.5.4灭菌同5.4.45.5.5接种压差法接入种子罐种子，接种量为7％～10％。5.5.6培养DB34/T802—20084同5.4.6，培养基达到一定工艺要求，无杂菌即可放罐。6液体菌种的使用方法用液体菌种接种器接种时，菌种瓶一般不用棉塞封口，而采用聚丙烯薄膜封口。接种时，先将待接种的菌种瓶成排地放在工作台上，依次将针管插入菌种瓶封口的薄膜内，每瓶接种量10ml～15ml菌液即可。塑料菌袋应进行多点接种，针管拔出后立即封闭塑料菌袋针孔，并竖立在培养架上进行培养。聚丙烯或聚乙烯材料执行GB9687-1988，GB9688-1988标准。7标签、贮存7.1标志出售的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。7.2贮存7.2.1母种保存方法夏、秋季节生产的高温菌类，母种应放在15℃的室内保存，冬季应移入恒温箱内，防止受冻；秋冬季节生产的菌种，可置于0～7℃的冰箱中保存。低温保存、每隔3～5个月就应转管移接一次，在适宜的温度下培养一星期，待菌丝基本布满斜面后，再放在低温中保存。7.2.2摇瓶种保存方法摇瓶培养的液体菌种用牛皮纸包好，放在4℃的温度下可保存5～7天。7.2.3种子罐液体菌种保存方法15～20℃室温可保存1～2天。DB34/T802—20085附录A（规范性附录）常用母种培养基A.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂(凝固剂)20g，水1000mL,pH值依据菌种调配。A.2综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA培养基）马铃薯200g(用浸出汁)，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL，pH值依据菌种调配。附录B（规范性附录）常用摇瓶种培养基B.1葡萄糖3.0％，豆饼粉2.0％，玉米粉1.0％，酵母粉0.5％，磷酸二氢钾0.1％，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05％，pH值依据菌种调配。B.2可溶性淀粉3.0％～6.0％，蔗糖1.0％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，酵母膏0.1％，pH6适合于多种食用菌。