DB33T 822-2011 高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测技术

ICS11.220B41DB33浙江省地方标准DB33/T822—2011高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测技术RT-PCRdetectiontechniqueforhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2011-03-25发布2011-04-25实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T822—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GB／T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的规定编写。本标准由浙江省农业厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心。本标准起草人：徐辉、李晓成、吴发兴、赵灵燕、张燕霞、倪柏锋、周彩琴、陆国林、吴赟竑、陈星宇、王燕萍、周蕾。DB33/T822—20111高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测技术1范围本标准规定了高致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR检测技术。本标准适用于猪只感染高致病性和美洲型经典猪蓝耳病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1高致病性猪蓝耳病highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome简称HP-PRRS，是由猪繁殖与呼吸综合症（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）（俗称蓝耳病）病毒变异株引起的一种猪的急性高致死性疫病。临床上表现为体温明显升高，可达41℃以上，眼结膜炎、眼睑水肿，咳嗽、气喘等呼吸道症状；部分猪出现后躯无力、不能站立或共济失调等神经症状。PRRSV是套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员。3.2逆转录-聚合酶链反应reversitranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。4缩略语下列缩略语适用于本标准。bpbasepair，碱基对。DNAdeoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。dNTPsDeoxyribonucleosideTriphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸。IFAimmunofluorescenceassay，免疫荧光测定。PCRpolymerasechainreaction，聚合酶链式反应。RT-PCRreversetranscriptionPCR，反转录PCR。Taq酶TaqDNAPolymerase，TaqDNA聚合酶。DB33/T822—20112DEPCdiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯。EBEthidiumbromide，溴化乙锭。5检测方法除另有规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水均为蒸馏水，规格符合GB/T6682的相关规定。5.1试剂5.1.1变性液:见附录A.1。5.1.22mol/L醋酸钠溶液(pH4.0)：见附录A.2。5.1.3水饱和酚（pH4.0）。5.1.4氯仿/异戊醇（49/1）混合溶液。5.1.5AMV反转录酶（200U/μL）。5.1.6RNA酶抑制剂(40U/μL)。5.1.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。5.1.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.3。5.1.950×TAE缓冲液：见附录A.4。5.1.10ＥＢ溶液(10μg/μL)：见附录A.5。5.1.11加样缓冲液：见附录A.6。5.1.12DEPC处理的灭菌双蒸水：见附录A.7。5.1.13异丙醇。5.1.14DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.8。5.1.155×AMV缓冲液5.1.162.5mmoldNTPs5.1.1710×PCR缓冲液5.1.18DNA分子量标准。5.1.19引物：见附录A.9。5.2仪器设备5.2.1高速冷冻离心机：最高转速应大于12000rpm。5.2.2PCR扩增仪。5.2.3核酸电泳仪和水平电泳槽。5.2.4恒温水浴锅。5.2.52℃～8℃冰箱和-20℃冰箱。5.2.6微量移液器（0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～1000µL）。5.2.7真空干燥器（非必备）。5.2.8凝胶成像系统（或紫外透射仪）。DB33/T822—201135.2.9超净工作台或通风橱。5.3操作程序5.3.1样品的采集和处理选择代表性病症的病死猪，无菌采集肺、脾、淋巴结和扁桃体等组织；常规监测临床健康待检猪可采集血清或淋巴结。0℃以下冷藏并在4h内送至实验室检测，或在-20℃的环境中保存备用。5.3.2RNA的提取5.3.2.1RNA提取方法RNA的提取方法采用异硫氰酸胍一步法，也可采用TRIZOL法或者市售商品化RNA提取试剂盒。注意事项参见附录B1。5.3.2.2异硫氰酸胍一步法步骤5.3.2.2.1每次试验前应设立阳性、阴性和空白对照。取组织样品进行研磨匀浆后冻融2次，12000rpm/min离心，5min。5.3.2.2.2取100μL组织匀浆上清，加入变性液300μL颠倒混匀，继续加入30µl2mol/L乙酸钠（pH值4.0）。反复颠倒离心管5次，一般在25℃的室温下放置5min。12000rpm/min、4℃离心并取上清。5.3.2.2.3再依次加入150μL饱和酚、150μL氯仿-异戊醇，然后盖上管盖，反复颠倒混匀5次，冰浴15min。5.3.2.2.4然后以12000rpm/min、4℃离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中，不应吸取水相的最下层。5.3.2.2.5加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置10min沉淀RNA。5.3.2.2.612000rpm/min、4℃离心10min，弃上清。5.3.2.2.7加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇颠倒混匀洗涤沉淀，12000rpm/min、4℃离心10min，弃上清。5.3.2.2.8将含有RNA沉淀的离心管静置干燥沉淀5min～10min，然后用20μLDEPC处理水将沉淀充分溶解，在-20℃条件下保存备用。5.3.3RT-PCR操作步骤5.3.3.1反转录5.3.3.1.1反转录引物使用下游引物PRRST2，42℃反应1.5h，合成cDNA链。20µL反转录体系中包括：RNA模板5μLRNA酶抑制剂(40U/µL)0.5μL5×AMVBuffer4µL2.5mmoldNTPs（2.5mmoL/µL）4µLDB33/T822—20114下游引物PRRST2（20pmoL/µL）1µLAMV反转录酶0.5μLDEPC水5µL总计20µL5.3.3.1.2使用商品化的反转录试剂盒也可按试剂盒使用说明进行。5.3.3.2PCR扩增5.3.3.2.1使用特异性引物对cDNA进行PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min，30个循环，每个循环包括：94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min结束。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。其中需加入抽提的阴性、阳性和空白对照作为参照。25µL的PCR反应体系中包括：10×PCRbuffer2.5µLdNTPs（10mmol/L）2µL上游引物PRRST1（20pmoL/µL）0.5µL下游引物PRRST2（20pmoL/µL）0.5µLDNA聚合酶(5U/µL)0.5µLcDNA3µL灭菌三蒸/超纯水16µL总计25µL5.3.3.2.2RT-PCR操作过程中的注意事项参见附录B.2。5.3.3.3电泳5.3.3.3.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.3。5.3.3.3.2取5μLPCR产物与0.5μL加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。5.3.3.3.3电泳时加入DNA分子量标准对照。5.3.3.3.4盖好电泳仪，插好电极，电压110V，电泳20min～30min。5.3.3.3.5用紫外凝胶成像仪或紫外透射仪观察扩增结果。5.3.3.3.6用分子量标准比较判断PCR片段大小。6结果判定6.1阳性、阴性对照检测结果在阳性对照出现421bp（HP-PRRSV）/511bp（美洲型）的扩增带、阴性对照无相应目标条带，该次检测成立，并判定结果。6.2待检样品检测结果待检样品出现421bp的扩增条带，判定为HP-PRRSV阳性；待检样品出现511bp的扩增条带，判定为美洲型PRRSV阳性；同时出现421bp、511bp的目标条带，则判定为HP-PRRS和美洲型PRRSV双阳性。没有出现421bp和511bp条带则判定为高致病性蓝耳病和经典美洲型猪蓝耳病病毒阴性。DB33/T822—20115AA附录A（规范性附录）相关试剂的配制A.1变性液将250g异硫氰酸胍、17.6mL0.75mol/L（pH7.0）柠檬酸钠和26.4mL10%（m/V）十二烷基肌酸钠溶293mL水中。65℃条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次使用前按每50mL变性液加入0.36mL的14.4mol/L的β-巯基乙醇。变性液可在室温下避光保存6个月。A.22mol/L乙酸钠溶液(pH4.0)在100mL容量瓶中，先加入16.4g乙酸钠，加入适量灭菌双蒸水，再用冰乙酸调pH至4.0后定容。A.31.0%琼脂糖凝胶的配制用琼脂糖1.0g，0.5×TAE电泳缓冲液100mL，混匀后在微波炉中完全融化，待冷至50℃～60℃时，加EB溶液5μL，摇匀倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.450×TAE电泳缓冲液A.4.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)在100mL容量瓶中，先加入EDTA18.61g，加入适量灭菌双蒸水，再用氢氧化钠调pH至8.0时定容。A.4.2TAE电泳缓冲液(50×)配制羟基甲基氨基甲烷(Tris)242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)100mL，加灭菌双蒸水至1000mL充分混匀。用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.5EB溶液EB20mg、加灭菌双蒸水至20mL充分溶解混匀而成。A.610×加样缓冲液聚蔗糖25g、溴酚蓝0.1g、二甲苯青0.1g，加灭菌双蒸水至100mL充分溶解混匀而成。A.7DEPC水DEPC100μL，加超纯水至100mL，室温过夜，121℃高压15min，分装到1.5mLDEPC处理过的微量管中，冻存备用。DB33/T822—20116A.875%乙醇用75mL无水乙醇，加DEPC水至100mL，混匀，4℃保存备用。A.9引物A.9.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV检测引物序列如下表A.1。表A.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV检测引物序列引物名称序列上游引物PRRST1：5’-ATGGGCGACAATGTCCCTAAC-3’上游引物PRRST2：5’-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3’A.9.2引物合成后短期内可4℃存放，需长期保存应冻存于-20℃。待用时应稀释至20pmol浓度。扩增时2条引物在同一体系中，扩增结束后出现大小为421bp的目的片段为HP-PRRSV，大小为511bp的目的片段则为美洲型PRRSV。DB33/T822—20117BB附录B（资料性附录）检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施B.1样品处理和核酸制备B.1.1样品处理过程中应穿实验服，戴一次性手套、口罩、帽子。一次性手套应经常更换。B.1.2提取RNA过程或PCR反应液配制过程应分别在专用的超净工作台内进行；未设专用超净工作台时可选取一个相对洁净的专用区域。B.1.3所有抽提RNA的试验器皿、离心管、PCR管