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ICS备案号：16720-2005DB四川省地方标准DB51/T469—2005鸡蛋中氯霉素残留检测方法—酶联免疫吸附测定(ELISA)法DeterminationofChloramphenicolResiduesinEggbyEnzyme-linkedImmunosorbentAssay2005-03-03发布2005-06-01实施四川省质量技术监督局发布7DB51/T469—20058前言为了规范我省无公害畜产品鸡蛋的生产和销售过程，保障人民的身体健康，维护生产者、经营者和消费者的合法权益，在总结国内外相关标准的基础上，制定了用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋中氯霉素残留量的标准。本标准按GB/T1.1—2000《标准的结构和编写规则》和GB/T1.2-2002《标准中规范性技术要求内容的确定方法》进行编制。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省兽药残留监控中心负责起草。本标准起草人:程江、彭莉、岳秀英、高岚、熊浩山。DB51/T469—20059鸡蛋中氯霉素残留检测方法－酶联免疫吸附测定法1范围本标准规定了鸡蛋中氯霉素残留量检测的制样方法和酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于鸡蛋中氯霉素残留量的快速筛选检测，检出限为0.3μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1.1-20001标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写手则（ISO/IECDirectives，Part3，1997，RulesforthestructureanddraftingofInternationalStandards，NEQ）GB/T6682-1992分析实验室用水规则和试验方法。3方法提要和原理鸡蛋中残留的氯霉素用乙腈-水溶液提取，乙酸乙酯萃取，正己烷除脂，用酶联免疫吸附测定法测定，其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，标样或样品中的氯霉素与酶标记抗原竞争氯霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中氯霉素浓度呈反比。4仪器4.1酶标仪（配备450nm滤光片）4.2旋转蒸发仪4.3匀浆器4.4振荡器4.5冷冻离心机4.6微量移液器单道20μl，50μl，100μl，1000μl；多道50-250μl4.7天平感量0.01gDB51/T469—2005104.8氮吹仪5试剂和材料以下所用试剂，除特殊注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。5.1乙酸乙酯5.2乙腈5.3正已烷5.40.5Mol/L氯化钠溶液取氯化钠2.9g，加水至100ml5.5乙腈-水溶液（84+16）5.6氯霉素检测试剂盒5.6.1氯霉素系列标准溶液0µg/L、0.1µg/L、0.3µg/L、0.9µg/L、2.7µg/L、8.1µg/L5.6.2酶标板8条×12孔，包被有偶联抗原5.6.3氯霉素特异性抗体5.6.4酶标记物5.6.5浓缩复溶液5.6.6洗涤液5.6.7底物溶液A、B5.6.8终止液6测定步骤6.1试样的制备取匀浆后的供试样品，作为供试试样。6.2试样提取和纯化称取(5±0.01g)匀浆物置离心管中，加入15ml乙腈-水溶液（84+16），混合，剧烈振荡10min。15℃，3000r/min离心10min。取3ml上清液，加入1ml0.5Mol/L氯化钠溶液和3ml乙酸乙酯，混合振荡10min，静置分层。将上层液移入另一管中用氮气吹干(或鸡心瓶中50℃减压蒸干)。用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入异辛烷1ml振荡5min。15℃，3000r/min离心5min，除去上层液。取50μl水相供ELISA测定。6.3试样测定（20℃～24℃条件下操作）6.3.1使用前将试剂盒置于室温（20~24℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。6.3.2加入50μL标准溶液或试样溶液到微孔底部，再加入50μl氯霉素特异性抗体工作液，用盖板DB51/T469—2005膜封板，37℃恒温箱中反应30min。6.3.3倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔中液体，在吸水纸上拍干，如此重复操作共洗板5次。6.3.4加入100μl酶标记物到微孔底部，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。6.3.5加入50μL底物液A、50μL底物液B到微孔中，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。6.3.6加入50μl终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（OD值）。7结果判定所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示：百分吸光度值=B×100%………………………………………（1.1）B0式中:B－为标准溶液或样品的平均吸光度值。B0－为0浓度的标准溶液平均吸光度值。以X轴为标准溶液中氯霉素浓度(ng/mL)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（ng/mL）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中氯霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中氯霉素的浓度。注：检测结果小于0.3μg/kg时，可判为阴性，大于0.3μg/kg时，判为可疑，需用确证法确认。11