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65.020.30B47DB51四川省地方标准DB51/T1185—2011桑蚕微粒子病诊断技术规程2011-01-25发布2011-03-01实施四川省质量技术监督局发布DB51/T1185—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农业科学院生物技术核技术研究所。本标准主要起草人：吴钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清、马露芸。DB51/T1185—20111桑蚕微粒子病诊断技术规程1范围本标准规定了四川省桑蚕微粒子病诊断技术要求。本标准适用于四川省桑蚕微粒子病的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20395桑蚕微粒子病病原鉴定方法DB51/T844桑蚕微粒子病防治技术规程3试剂3.1浓盐酸[w(HCl)=30％]。3.2氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]。3.3过氧化氢溶液[w(H2O2)=10％]。3.4分析用水按GB/T6682规定执行。4仪器、设备4.1普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数15×40倍或16×40倍；生化培养箱（温控范围10℃～50℃）、冰箱；天平（感量：0.1g）、离心机。4.2离心管、无纺布滤纸；载玻片、盖玻片、测微尺；容量瓶、量筒、烧杯、二重皿；乳钵、乳棒；解剖剪、镊子、橡皮吸管；样品袋、冻存管（1.8mL、5mL）。5诊断5.1肉眼诊断5.1.1外观观察通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状：a)小蚕期：收蚁后不疏毛、体色深暗、体躯瘦小、发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐。DB51/T1185—20112b)大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸腹足外侧部位较多；蜕皮困难，严重死亡；群体发育不齐。c)蛹蛾期：蛹表皮无光泽、反应迟钝、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑，感病严重的不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鳞毛脱落、腹部膨大、节间松弛，交配能力差，产卵少。d)卵期：卵形不正，排列不齐、多重叠卵，卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多；催青期发育不整齐。5.1.2解剖观察将外观观察的具有上述大蚕期典型病症的病蚕，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白色脓疱状斑块。5.1.3判定通过外观观察，蚕的不同发育阶段出现5.1.1表述症状之一的，可疑似为蚕微粒子病；通过解剖观察，大蚕期病蚕丝腺出现可见的乳白色脓疱状斑块时，可确诊为蚕微粒子病。5.2显微镜诊断5.2.1样品采集采集5.1.1描述的典型症状蚕、蛹、蛾、卵。采集的样品置于样品袋或冻存管中，做好记载。5.2.2样品处置5.2.2.1样品保存采集的样品每份混合均匀后再分成2份，其中1份作为检样按照5.2.2.2制备检验，另1份作为备样，保存于0℃～4℃冰箱中，保存期30d～60d。5.2.2.2样本制备5.2.2.2.1不同发育时期的样品，按照下列方法制样：a)蚁蚕样品置生化培养箱于温度29℃±0.5℃、相对湿度≥85%条件下，放置2d～3d。b)小蚕期、大蚕期、蛹期、蛾期样品置生化培养箱于温度29℃～32℃、相对湿度≥85％条件下，放置2d～5d；大蚕期、蛹期经高温处置的样品，可用解剖剪沿背中线剪开，摘取其中肠，每1头～5头蚕或1粒～2粒蛹的中肠为1个样。c)卵期样品解除滞育后，在生化培养箱温度29℃±0.5℃、相对湿度≥85％的条件下催青；孵化后待其自然死亡。5.2.2.2.2将上述制备的样本每份分别置于1个乳钵孔中，每孔各放1个乳棒，磨碎；滴入4滴～10滴氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]，再次研细。5.2.2.2.3按照乳钵序号，将磨碎液用乳棒点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样本。5.2.3显微镜检查5.2.3.1直接观察法将镜检样本，置于显微镜（15×40倍或16×40倍）下观察，每个样本观察不少于20个视野，观察有无微粒子孢子。DB51/T1185—201135.2.3.2离心沉淀法将5.2.2.2.2制备的磨碎液，用无纺布滤纸过滤后，将滤液移入离心管中，经3000r/min离心3min，倾去上清夜，沉淀物振荡制镜检样本，置于显微镜（15×40倍或16×40倍）下观察，每个样本观察不少于20个视野，观察有无微粒子孢子。5.2.3.3酸溶解法将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取2滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中1点加1滴浓盐酸[w(HCl)=30％]，另1点作对照，在30℃生化培养箱中放置10min～20min后，盖上盖玻片镜检（15×40倍或16×40倍）。如果样本已干，可加无菌水1滴。经过酸处理的样本，微粒子孢子溶解消失，真菌孢子保持原状。5.2.3.4过氧化氢法将5.2.3.1、5.2.3.2镜检出有微粒子孢子原液吸取1滴，滴于载玻片上，再将过氧化氢溶液[w(H2O2)=10％]1滴～2滴滴于孢子液中，盖上盖玻片，经过10min～30min，相衬（相差）显微镜镜检（15×40倍或16×40倍），活微粒子孢子释放出极丝。5.2.4判定当镜检发现孢子呈长卵圆形，大小为3.6μm～3.8μm×2.0μm～2.3μm，呈淡绿色，折光性强，中间隐约可见1根黑色线状物，表面光滑，孢子活泼，多左右摆动，有时可见翻滚现象时，孢子则为蚕微粒子孢子（参见GB/T20395附录A微粒子孢子图），原样品确诊为蚕微粒子病。加浓盐酸作用后，被溶解的孢子为微粒子孢子，原样品确诊为蚕微粒子病。加过氧化氢作用后，活微粒子孢子释放出极丝，原样品确诊为蚕微粒子病。_________________________________