外植体2

第四节外植体的接种第五节外植体的褐变及其预防措施外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。第四节外植体的接种1．操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果,进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。2．操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。3．在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。4．工具用后及时消毒，避免交叉污染。5．工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。•6．由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。第五节外植体的褐变及其预防措施一、什么叫褐变？褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。二、褐变的原因是什么？褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不，最终衰老死亡。三、影响褐变的因素有哪些？随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。1．植物材料（1）基因型不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。人们已经注意到，木本植物（木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，而酚类休合物含量高将导致褐变的发生，因此，木本植物一般比草本植物容易发生褐变。（2）材料年龄幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。平吉成从小金海棠、八楞海棠和山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。Chever分析欧洲栗的酚类含量变化的结果表明，幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。（3）取材部位Yu和Meredith在葡萄上发现从侧生蔓切取茎尖进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活，进一步分析酚类含量发现前者比后者少。而苹果则顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。分生部位接种后醌类物质形成少；而分化部位接种后醌类物质形成多。（4）取材时期多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。Chever报道，欧洲栗在1月15日-30日醌类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明显提高。蒋迪军和牛建新报道，金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重,当茎尖长度在5mm-15mm时褐变较轻,成活率可达85%。在多个苹果品种上试验结果表明，用5mm-10mm长的茎尖进行培养效果最好，茎尖如果太小很容易发生褐变。另外，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。（5）外植体大小及受伤害程度主要是光照与温度。温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。2．培养条件（1）培养基状态由于培养基中琼脂的用量和pH值的高低不同，培养基可配成固体培养基、半固体培养基或液体培养基。许多试验证明，液体培养基可经有效克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。3．培养基在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。原因是无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子，因此盐浓度过高会增加这些酶的活性，酶又进一步促进酚类合成与氧化。（2）无机盐（3）植物生长调节物质有报道说，初代培养处在黑暗条件下，生长调节物质的存在是影响褐变的主要原因，此时去除生长调节物质可减轻褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。而生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。（4）抗氧化剂培养基中加入抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。（5）吸附剂活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，这在东北红豆杉、猪笼草、鸡蛋果、鹤望兰、杜鹃花、苹果、桃和倒持金钟等植物上都有过报道。在倒挂金钟茎尖培养中只加入0.01%PVP便对褐变有抑制作用。（6）pH值培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而pH值升高则明显加重褐变。4．材料转瓶周期对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变。在山月桂树的茎尖培养中，接种后12h～24h，便转入液体培养基中，这之后的一周内，每天转一次瓶，褐变得到完全控制。在无刺黑莓上也有类似经验。四、褐变的预防措施有哪些？1．选择适宜的外植体外植体应选择分生能力较强的材料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。2．采用适宜的培养基和光温条件培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d～40d，可以显著减轻材料的褐变。3．在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂在培养基中加入0.1%～0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。如在培养基中加抗坏血酸、血清白蛋白、有机酸、蛋白质、蛋白质水解产物、氨基酸、硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、亚硫酸氢钠、氰化钾、苏糖二硫醇等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。4．缩短转瓶周期这是组培中控制褐变常用且有效的方法。第五节外植体的培养条件•接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。1．光照对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。2．温度离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C±2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。•3．湿度组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。4．氧气植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。