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65.020.30B47DB51四川省地方标准DB51/T1207—2011桑蚕血液型脓病诊断技术规程2011-01-25发布2011-03-01实施四川省质量技术监督局发布DB51/T1207—2011I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农科院生物技术核技术研究所。本标准主要起草人：马露芸、吴钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清。DB51/T1207—20111桑蚕血液型脓病诊断技术规程1范围本标准规定了四川省桑蚕血液型脓病诊断的技术要求。本标准适用于四川省桑蚕血液型脓病的诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1核型多角体nuclearpolyhedralbody在桑蚕血细胞和体腔内各种组织感染细胞的细胞核中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶体，多呈比较整齐的六角形。3.2质型多角体cytoplasmicpolyhedralbody在桑蚕中肠感染细胞的细胞质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶体，多为六角形，或有四角形，偶有三角形。3.3血液型脓病(核型多角体病)nuclearpolyhedrosis病毒寄生在桑蚕血细胞和体腔内各种组织细胞，使其血液浑浊呈乳白的蚕病；并在细胞核中形成多角体，又称核型多角体病。4试剂4.1焦宁—甲基绿染液A液：焦宁[w(C17H19ClN2O)=5％]15.5mL甲基绿[w(C27H35Cl2N3.ZnCl2)=2％]10mL无菌水250mLDB51/T1207—20112B液：醋酸缓冲液pH4.8使用前将A、B两液等体积混合。4.2苏丹Ⅲ染色剂0.5g苏丹Ⅲ溶于100mL95%乙醇中，过滤后，加入少许甘油。4.3氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]。4.4盐酸溶液[c(HCl)=1mol/L]。4.5化学纯乙醇（C2H5OH）。4.6化学纯乙醚（C4H10O）。4.7分析用水按GB/T6682规定执行。5仪器、设备5.1普通光学显微镜、相差显微镜，放大倍数15×40倍或16×40倍；恒温培养箱（5℃～65℃）、冰箱；天平（感量0.1g）。5.2载玻片、盖玻片；乳钵、乳棒；解剖剪、镊子、吸管；量筒、烧杯；样品袋、冻存管（1.8mL、5mL）。6诊断6.1肉眼诊断6.1.1外观观察肉眼观察蚕在不同发育阶段是否具有下列症状。a)不眠蚕：发生于各龄眠期。体色乳白，体躯肿胀，狂躁爬行，体壁发亮，皮破流脓。b)起节蚕：发生于各龄眠起时。生长停滞，体色乳白；体壁松弛，体躯缩小；前节的节间膜向后套叠。c)斑蚕：发生于3龄～5龄。焦脚蚕、黑气门蚕、焦脚和黑气门同时出现的对称性斑蚕。d)高节蚕：发生于4、5龄盛食期。各环节间膜或各环节后半部靠近节间膜处隆起，形如竹节。e)脓蚕：发生于5龄后期至上蔟前。环节肿大，体壁发亮，体色乳白；爬行缓慢，皮破流脓。迟发病蚕死于蔟中或结薄皮茧后死亡。f)病蛹：5龄后期感染，部分能营茧化蛹。病蛹体色暗褐，体壁易破。6.1.2解剖观察将外观观察的具有上述病症的病蚕，用解剖剪剪去尾角或腹足，观察滴出的血液颜色。6.1.3判定通过外观观察，不同发育阶段的蚕出现6.1.1表述的症状之一时，可初步诊断为血液型脓病；通过解剖观察，滴出的血液呈乳白色浓汁，可诊断为血液型脓病。DB51/T1207—201136.2显微镜诊断6.2.1样品采集采集6.1.1描述的典型症状蚕、蛹。采集的样品置于样品袋或冻存管中，做好记载。6.2.2样品处置6.2.2.1样品保存样品每份混合均匀后再分成2份，其中1份作为检样制备检验，另1份作为备样，保存于0℃～4℃冰箱中。保存期30d～60d。6.2.2.2样本制备——用解剖剪剪去未病死蚕的尾角或腹足，制成血液样本。——病死蚕或蛹置于乳钵中，采取整头（粒）研磨的方法，加入4滴～10滴氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]，用乳棒研细，制成磨碎液样本。6.2.3显微镜检查6.2.3.1直接观察法取待检样本一滴涂抹于载玻片上，盖上盖玻片，分别置于显微镜（15×40倍或16×40倍）下观察，每个样本观察不少于20个视野，观察有无多角体。6.2.3.2多角体与脂肪球鉴别6.2.3.2.1苏丹Ⅲ染色法取待鉴样本一滴涂抹于载玻片上，自然干燥后，加一滴苏丹Ⅲ染色剂，5min后盖上盖玻片镜检，脂肪球呈红色或橙黄色，多角体不着色。6.2.3.2.2有机溶剂溶解法取待鉴样本一滴涂抹于载玻片上，自然干燥后，加一滴乙醇乙醚的等量混合液。待混合液蒸发后，加无菌水一滴，盖上盖玻片镜检，脂肪球溶解消失，多角体存在。6.2.3.3核型多角体和质型多角体鉴别用焦宁—甲基绿染色法。经6.2.3.2鉴别有多角体存在的磨碎液样本，取1滴涂抹于载玻片上，自然干燥后，用吸管滴1滴~2滴盐酸溶液[c(HCl)=1mol/L]，在室温下放置1min～2min后，移入60℃恒温箱中放置1min～5min，取出用少量无菌水冲洗，加一滴焦宁—甲基绿染色液，常温下染色1min～5min，用少量无菌水冲去浮液，镜检，核型多角体呈绿色，质型多角体呈红色。6.2.4判定血液样本经镜检发现多角体存在，呈六角形、大小均匀、折光性较强时，原样品确诊为桑蚕血液型脓病。磨碎液样本经镜检发现多角体存在，呈六角形、大小均匀、折光性较强时，原样品可初步诊断为桑蚕血液型脓病，再用焦宁—甲基绿染色法鉴别，镜检时有绿色多角体的，确诊为桑蚕血液型脓病。DB51/T1207—20114_________________________________