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1DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院,2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical(DPPH•)ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily.Chemistryselect,2018.3,13081-13086.[2]Li,X.;Ouyang,X.;Cai,R.;Chen,D.3’,8”-DimerizationEnhancestheAntioxidantCapacityofFlavonoids:EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2019,Molecules.24,2039.[3]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide(PTIO•)RadicalScavenging:ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.J.Agric.FoodChem.,2017.65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表：DPPH•自由基ABTS+•自由基PTIO•自由基结构式NNO2NO2NNO2NNOO简单表达式DPPH·ABTS·+PTIO·分子式与分子量C18H12N5O6;M.W.394.3C18H24N6O6S;M.W.548.68C13H17N2O2;M.W.233.3带电情况中性自由基阳离子自由基中性自由基种类氮自由基（成单电子在N原子上）氮自由基（成单电子在N原子上）氧自由基（成单电子在O原子上）外观紫黑色粉末没有纯的ABTS·+紫褐色粉末溶解性与溶液颜色溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）溶液呈紫色，浓度越高，颜色越深溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）、水以及水性的缓冲液溶液呈墨绿色，浓度越高，颜色越深溶于水以及水性的缓冲液溶液呈蓝紫色，浓度越高，颜色越深CAS号1898-66-4无18390-00-6工作液配制方法将已购的DPPH自由基粉末，溶解即得其工作液将已购的ABTS二铵盐[(NH4)2ABTS]与过二硫酸钾(K2S2O8)黑暗中反应12小时后，再稀释得其工作液。将已购的PTIO自由基粉末，溶解即得其工作液2工作液外观紫色墨绿色蓝紫色工作液紫外光谱与最大吸收2004006008000.00.51.01.52.02.53.0吸光度波长/nm519nm(50μg/mL)2003004005006007008009000.00.51.01.52.0734nm吸光度波长/nm415nm（0.07mM(NH4)2ABTS+0.03mMK2S2O8）200400600800012吸光度波长/nm557nm(50μg/mL)检测波长519nm734nm557nm（水溶液）检测原理当A519nm值减少，表明DPPH·被清除。其清除机制主要是氢转移HAT(hydrogenatomtransfer)当A734nm值减少，表明ABTS·+被清除。其清除机制主要是电子转移ET(electrontransfer)当A557减少，表明ABTS·+被清除。其清除机制主要是电子移ET(electrontransfer)加质子转移PT(protontransfer)用途主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。通过调节缓冲液的pH值，可以检测其抗氧化机制。优势清除速度较快，约30分钟（室温下）。清除速度较快，约6分钟（室温下）。（1）水溶性好，与生物相关性强；（2）是氧自由基，能更好地表往ROS清除水平；（3）抗氧化机制明确：pH值小于5.0时，为电子转移ET机制。当调节pH值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH值有关，也就是说与氢离子（质子）浓3度有关，据此，可证明其涉及PT机制。局限性（1）只能在有机溶剂（如甲醇、乙醇）中进行，不能在水溶液中进行；也不能在缓冲液中进行。（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）虽然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶剂中，其抗氧化机制是不同的，还可能有ET等。（1）不能在缓冲液中进行。当然，可以在有机溶剂（如甲醇、乙醇）和水溶液中进行。（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）配制工作液需要的时间长（约12小时）（4）ABTS·+与(NH4)2ABTS、K2S2O8共存于溶液中，无法单独分离。所以，会导致无法预期的干扰。清除反应速度较慢，约2小时完成。不过，如果出现这种情况，可以适当加热（如37℃、50℃），或延长反应时间。所需仪器可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）4【实验讲解】1.DPPH•自由基清除实验[1]1.1DPPH测试液的配置取DPPH固体1mg溶于24mL95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。最好避光保存，5小时内用完。取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。1.2样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。1.3预试取DPPH溶液1.0mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。【如】在预试过程中，发现加样到500μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL。A0值：取DPPH溶液1.0mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。A值：取（500-x）μL有机溶剂到比色皿中，加样品液xμL（x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0mL，混合使反应液总体积为1.5mL。测A值。【如】某样品的用量梯度为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，则加样如下：样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积0μL100μL500μL400μL1.0mL1.0mL1.5mL1.5mL200μL300μL1.0mL1.5mL300μL200μL1.0mL1.5mL400μL100μL1.0mL1.5mL500μL0μL1.0mL1.5mL1.4最终测量每测一个用量需要测三个平行数据。1.5DPPH•清除率（抑制率）的计算500=100AAA清除率%(A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值。)1.6使用注意事项1.6.1测量前，要先用空白溶剂调零。1.6.2将溶液注入比色皿后应当充分摇匀，使颜色均匀分布。1.6.3每次使用前后要注意比色皿的清洁。1.6.4如果在实验过程中出现A值大于A0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致，此时，应该减去本底吸收的A值(A本)。这个A本值可以通过，加样品但不加DPPH的方法测得。此时的计算公式为：00()=100AAAA本清除率%1.7疑难解答问：DPPH实验测量抗氧化性的原理是什么？答：DPPH法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在519nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，溶液颜色减淡，其褪色程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。问：DPPH自由基被清除的机制是什么？答：DPPH自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT），简要过程如下（以1,3,5,8-四羟基氧杂蒽酮为例）：问：实验中的溶剂应该怎么确定？6答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？答：不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数值，实验中要根据预试结果进行调整。由于1mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：测量完成后怎么计算IC50？答：IC50值是指清除50%的自由基，所需要的样品的最终浓度。有两种计算方法。第一，以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值，注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。第二，通过浓度曲线的图直接读出。在50%处画一横线，此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标，即IC50.另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：为什么要用Trolox作为阳性对照？答：维生素E（生育酚）是常见的抗氧化剂。不过，维生素E难溶于水，而且易变质。为此，化学家将其结构进行修饰，即得Trolox（化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。Trolox不仅溶于水，而且易溶于有机溶剂，所以，广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。亦称水溶性维生素E。为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力，通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：为什么会出现清除率为负值的情况？答：样品的活性太弱，所以，加入的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话，就会产生一个可观的A值，导致AA0,清除率为负。问：DPPH•清除率会大于100%吗？答：不可能。1.8实例茶黄素清除DPPH•自由基数据：样品浓度:0.1mg/ml反应液总体积:1.5mL体积/uL最终浓度μg/mLA0平均值A值清除率123123MeanSD201.3330.8060.6120.6190.63224.06923.20121.58822.9531.028402.6670.8060.4900.4860.48639.20639.70239.70239.5370.2347604.0000.8060.3720.3630.36653.84654.96354.59154.4670.464805.3330.8060.2900.2990.30264.02062.90362.53163.1510.6331006.6670.8060.2500.2390.24968.98370.34769.10769.4790.616IC50(μg/mL)3.9983.9754.0564.0100.034量效曲线图(MicrocalOrigin绘制)：0123456701020304050