DB11T 829-2011 白菜品种纯度及真实性分子检测方法

ICS65.020.20B21备案号：DB11北京市地方标准DB11/T829—2011白菜品种纯度及真实性分子检测方法MethodsofidentifyingvarietalpurityandgenuinenessofChinesecabbagebyusingmolecularmarkers2011-11-10发布2012-03-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T829—2011I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语与定义.........................................................................14原理...............................................................................25仪器设备及耗材.....................................................................26试剂和溶液配制.....................................................................27引物选用原则及筛选方法.............................................................38操作步骤...........................................................................49检测结果...........................................................................6附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法..............................................8附录B（资料性附录）白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列.......................11附录C（资料性附录）白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列........................13附录D（规范性附录）白菜基因组DNA提取方法.........................................15附录E（规范性附录）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法...................................17附录F（规范性附录）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法.................................19DB11/T829—2011II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市种子管理站。标准主要起草人：田雷、赵山普、贾希海、赵青春、彭瑞迪、王辉、福德平、高勇、张连平、黄寰。DB11/T829—20111白菜品种纯度及真实性分子检测方法1范围本标准规定了结球白菜和不结球白菜种子品种纯度及真实性鉴定的SSR、ISSR分子标记检测方法和对检测结果的判定标准。本标准适用于结球白菜和不结球白菜常规种子、杂交种子及其亲本的品种纯度和真实性鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1SSR标记simplesequencerepeatmarker，SSR简单重复序列（SSR）,又称短串联重复序列或微卫星序列，它是一类以1bp～5bp的短核苷酸序列为基本单位串联重复状分布于整个基因组内的重复序列。3.2ISSR标记intersimplesequencerepeatmarker，ISSR内部简单重复序列(ISSR)，是利用包含重复序列并在3’端或5’端锚定的单寡聚核苷酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶的作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，使引物得以延伸。然后不断重复变性、退火和延伸这一循环过程，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。3.4引物primerDB11/T829—20112在DNA合成反应时，提供3’－OH末端作为DNA合成的起点,能够与DNA模板特定区域特异结合的多核苷酸单链。4原理简单重复序列（SSR）和内部简单重复序列(ISSR)广泛分布于白菜基因组的不同位置上。每个位点的重复单位或序列会因为品种的不同而存在遗传结构上的差异，这些差异表现为多态性。针对重复单位或序列的不同，设计相应的SSR引物和ISSR引物，通过PCR技术进行扩增、电泳、染色，形成白菜品种的SSR和ISSR指纹图谱，进行白菜品种纯度和真实性的鉴定。5仪器设备及耗材5.1仪器设备5.1.1天平(感量0.0001g、0.001g、0.01g、0.1g）。5.1.2水浴锅(0℃～100℃）。5.1.3微波炉（额定功率800W）。5.1.4酸度计。5.1.5磁力搅拌器。5.1.6高速台式离心机（12000r/min）。5.1.7高压灭菌锅。5.1.8冰箱（最低温度-20℃）。5.1.9微量加样枪（0.5µL～10µL,20µL～200µL,100µL～1000µL）。5.1.10PCR扩增仪。5.1.11紫外成像仪。5.1.12紫外分光光度计。5.1.13水平仪。5.1.14高压电泳仪（0V～3000V、0mA～400mA、额定功率400W）。5.1.15电泳槽。5.1.16染色盒（55cm×38cm×8cm）。5.1.17水平摇床。5.1.18胶片观察灯。5.1.19数码照相机。5.2耗材离心管（0.2mL、0.5mL、1.5mL、2.0mL）、枪头（10µL、200µL、1mL）、96孔PCR板、一次性手套、夹子、吸水纸、玻璃棒等。6试剂和溶液配制6.1试剂除另有规定外，仅使用分析纯试剂。6.1.1乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2）。DB11/T829—201136.1.2三羟甲基氨基甲烷（Tris）。6.1.3盐酸（HCl）。6.1.4硼酸（H3BO3）。6.1.5十二烷基硫酸钠（SDS）。6.1.6氯化钠（NaCl）。6.1.7乙酸钠（NaAc）。6.1.8Tris-饱和酚。6.1.9三氯甲烷。6.1.10异戊醇。6.1.11异丙醇。6.1.12无水乙醇。6.1.13四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTP。6.1.14TaqDNA聚合酶。6.1.1510×PCR缓冲液。6.1.16DNA标准分子量标记（Marker）。6.1.17SSR引物。6.1.18ISSR引物。6.1.19丙烯酰胺。6.1.20N，N’－亚甲基双丙烯酰胺。6.1.21N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED）。6.1.22过硫酸铵[(NH4)2S2O8]。6.1.23尿素。6.1.24亲水硅烷（bind-silane）。6.1.25疏水硅烷（repel-silane）。6.1.26甲酰胺。6.1.27溴酚蓝。6.1.28二甲苯青FF。6.1.29冰乙酸（HAc）。6.1.30硝酸银（AgNO3）。6.1.31甲醛。6.1.32琼脂糖。6.1.33蔗糖。6.1.34溴化乙锭（EtBr）。6.1.35超纯水。6.1.36蒸馏水。6.2溶液配制按照附录A的规定配制溶液。7引物选用原则及筛选方法7.1引物选用原则DB11/T829—201147.1.1应优先选用核心引物库中的引物。当不能满足需求时，可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。7.1.2当自行筛选适宜品种纯度检测的SSR引物时，应遵循扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲互补带型，条带清晰、重复性好的原则。7.1.3当自行筛选适宜真实性鉴定的ISSR引物时，应遵循扩增后的ISSR电泳谱带多态性高，条带清晰、重复性好的原则。7.2引物筛选方法7.2.1自行筛选用于品种纯度检测的SSR引物时，选取有代表性的杂交种种子10粒及父母本种子各5粒。利用一系列SSR引物进行试验，根据扩增后的杂交种电泳谱带含有双亲互补带型，条带清晰、重复性好的原则，确定适宜的引物。7.2.2自行筛选用于真实性检测的ISSR引物时，选取有代表性的常规种子或杂交种种子5粒～10粒及至少10个以上不同品种。利用一系列ISSR引物进行试验，根据扩增后的常规种或杂交种电泳谱带多态性高，条带清晰、重复性好的原则，确定适宜的引物。7.3核心引物库7.3.1白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列参见附录B。7.3.2白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列参见附录C。8操作步骤8.1纯度检测8.1.1样品DNA的提取使用种子直接提取DNA进行检测的样品数量，按照GB/T3543.5的规定，从送检样品中随机数取100粒种子作为试样；使用幼苗提取DNA进行检测的样品数量，按照GB/T3543.4的规定，从净种子中随机数取一定数量种子（保证100株幼苗）作为试样，进行幼苗培养。按照附录D规定的方法提取样品DNA。8.1.2SSR-PCR扩增8.1.2.1SSR-PCR反应体系SSR-PCR反应的总体积为20uL，反应体系见表1。表1SSR-PCR反应体系试剂SSR-PCR终浓度SSR-PCR体积超纯水—10.7µL10×PCR缓冲液1×2µL25mmol/L氯化镁溶液2.5mmol/L2µL2.5mmol/LdNTP混合溶液0.25mmol/L2µL10µmol/L上、下游引物溶液0.5µmol/L1µL5U/µLTaq酶1.5U/管0.3µLDNA模板10ng/µL～50ng/µL2µLDB11/T829—20115表1SSR-PCR反应体系（续）试剂SSR-PCR终浓度SSR-PCR体积总体积—20µL备注如果10×PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积超纯水。8.1.2.2SSR-PCR反应程序参数SSR-PCR反应程序参数见表2。表2SSR-PCR反应程序参数程序SSR-PCR反应温度、时间循环数预变性95℃，5min1个循环降落PCR变性：94℃，45s退火：60℃～51℃，1min延伸：72℃，1.5min10个循环，退火温度每1循环下降1℃扩增变性：94℃，45s退火：50℃，45s延伸：72℃，1min35个循环最终延伸72℃，7min1个循环保存4℃，无限长1个循环注：使用不同的PCR扩增仪，应对仪器进行调整。8.1.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照附录E规定的方法，进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。8.2真实性鉴定8.2.1样品DNA的提取使用种子直接提取DNA进行鉴定的样品数量，按照GB/T3543.5的规定，从送检样品和标准样品中各随机数取10粒