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CRISPR(Cas9)System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)1、gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多）40ul体系，利用保真性=Extaq的酶扩增4管；可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）;沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带；以上模板皆用20ulDEPC水回溶(,反复洗柱子两次)。2、gRNA合成：10ul5Xtranscription2ulN(A/U/G/C)mix4ultemplate3ulT7enzymemix1ul反应温度37℃，时间3-4h。3、gRNA纯化a.加入1ulDNaseI，37℃处理15min；b.加入1ul0.5MEDTA8.0，65℃处理10min；c.加入57.5ulDEPCwater和7.5ul3MsodiumAcetatesolution(pH5.2);d.加入等体积（即77ul）酚氯仿（1:1mix）；12000rpm，15min；e.吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min；f.重复操作e；g.收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min；h.12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀；i.70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）；j.去除70%，自然干燥，10-20ulDEPCwater溶解；-80℃保存。注意：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tipsandtubes，尽量不说话，避免RNA酶污染。以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关说明书。4、Cas9template准备（酶切4h，40ul体系）将zf-cas9-vector线性化，即XbaI单酶切；酶切2tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶回收柱子；20ulDEPCwater回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。5、cas9-mRNA合成20ul（或10ul）根据需求量选择（减半）Template6ul2XNTP/cap10ul10Xbuffer2ulT7ENzyme2ul反应温度37℃，时间4.5h。纯化：A．加入1ulDNaseI，37℃处理15min；B．20ul反应体系，加入30ulLiCl；C．冰浴或-20℃沉淀至少30min；D．4℃,12000rpm,15min;E．100ul70%乙醇洗2次（每次12000rpm，6min）；F．10ulDEPCwater溶解；-80℃保存。注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。一般1ul/tube保存。CRISPR(Cas9)System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)6、斑马鱼注射：利用混合好的cas9与gRNA样品注射（混合后终浓度分别为300ng/ul和20ng/ul,如果注射效果不佳，可自行提高混合比例再次注射，最好不要超过500ng/ul和80ng/ul）7、F0注射胚胎检测准备：50mMNaOH、1MTris-HClPH8.0；30%PAGE；5XTBE；10%APS；5XTBE12%PAGE-gel：（两块）说明：其他所需溶液请自行查询《分子克隆》的配方。8、基因组提取及PCRa.8embryos/Tube，加入80ul50mMNaOH，95℃，40min；（可取3-5tubes）b.加入1/10体积1MTris-HClPH8.0；mixwell，3000rpm，5min；c.取1ul作为template，PCR扩增包含靶位点的基因片段；d.加6xloadingbuffer，run12%PAGE-gel；、e.EB染色，凝胶成像仪拍照看条带结果；f.如果条带与WT存在差异，则说明敲除有效果；9、养鱼将test有效果的靶位点对应的F0代斑马鱼饲养起来；10、筛鱼a.将成熟的F0代斑马鱼与WTmate，取其发育24h的胚胎test，方法同8；b.将test有效果的靶位点对应的F1代斑马鱼饲养起来；c．1个月大的幼鱼，剪尾鳍提基因组逐条test；（如图）11、测序PCR产物(胶块)直接测序；T-clone直接菌液测序；前者读峰图获得结果后者与标准序列blast获得；具体如下例：（在标准序列上找到套峰之前的序列，读出套峰处的碱基，重叠套峰上下写，最后将套峰处标准序列（序列1）找到，其他碱基组合即为序列2；比较后得出碱基缺失情况。）T-clonesequence获得单一序列（有野生型sequence及mutantsequence，与网上序列blast后，有碱基缺失的即为突变情况）Tris-base54g硼酸27.5g0.5MEDTA(PH8.0)20ml总体积定容1000ml30%4mlwater3.93ml5XTBE2ml10%APS70ulTEMED3.5ulCRISPR(Cas9)System斑马鱼基因敲除-实验流程(张大伟)12、后续筛鱼及传代（标准程序）A:F0XWTF1B:F1XWTF2C:F2XWTF3D:F3XF3观察表型注：step12的传代都是要通过剪尾鳍test传代的。