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ICS65.120B46DB13河北省地方标准DB13/T1384.1—2011饲料中4种β－内酰胺类药物的测定Determinationoffourkindsofβ-lactamsinfeed2011-05-10发布2011-05-20实施河北省质量技术监督局发布DB13/T1384.1—2011I前言本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北大学、河北省食品质量监督检验研究院、河北医科大学、北京出入境检验检疫局技术中心、石家庄市疾病预防控制中心、河北省饲料产品质量监督检验站。本标准主要起草人：张岩、李挥、吕品、丛斌、卢晓宇、张敬轩、沈磊、米振杰、贾茜、张宏、杨立学、李志平、高振同、武英利。DB13/T1384.1—20111饲料中4种β－内酰胺类药物的测定1范围本标准规定了饲料中青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林4种β-内酰胺类药物的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于饲料中青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林的测定。本标准的方法检出限：青霉素G、青霉素V为1.0μg/kg；氨苄西林、阿莫西林为2.0μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理试样中的4种β-内酰胺类药物残留，用OasisHLB或相当的固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。4.2乙腈：色谱纯。4.3乙酸：优级纯。4.4乙腈+水（1＋3）：量取25mL乙腈与75mL水混匀。4.5OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。4.6青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林：纯度≥99％。4.7青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质，分别用乙腈配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。储备液贮存在-18℃冰柜中。4.8青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林标准工作溶液：根据需要吸取适量青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林标准储备溶液，用空白样品稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液。5仪器5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。DB13/T1384.1—201125.3漩涡混匀器。5.4固相萃取真空装置。5.5微量进样器：25μL，100μL。5.6刻度样品管：5mL，精度为0.1mL。5.7真空泵：真空度应达到80kPa。5.8pH计：测量精度0.01。5.9氮吹仪。5.10高速离心机。6测定步骤6.1试样溶液的制备称取5g试样（精确到0.01g）置于100mL离心管中，加人45mL去离子水，于漩涡混匀器上快速混合5min，以5000r/min离心10min，将上清液移至OasisHLB柱中，以小于或等于3mL/min的流速通过固相萃取柱后，用5mL水洗柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干20min，最后用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液于刻度样品管中，于40℃水浴中用氮吹仪吹干，用乙腈定容至1mL，摇匀后，供液相色谱-串联质谱仪测定。6.2测定6.2.1液相色谱条件色谱柱：SunFireTMC183.5μm，150mm×2.1mm或相当者。流动相及流速见表1。柱温：30℃。进样量：20μL。表1液相色谱梯度洗脱条件时间/min流速/（μL/min）水（含0.4％乙酸）/（％）乙腈/（％）0.0020060.040.015.0020035.065.015.0120060.040.025.0120060.040.06.2.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测。定性离子对、定量离子对，见表2。其余质谱条件见附录A。DB13/T1384.1—20113表2定性离子对与定量离子对青霉素G青霉素V氨苄西林阿莫西林定性离子对（m/z）335/160335/176351/160351/192350/192350/160366/114366/208定量离子对（m/z）335/160351/160350/160366/2086.2.3液相色谱－串联质谱测定6.2.3.1定性测定在相同试验条件下，样品中待测物质与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5％之内；样品色谱图中各定性离子对相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的色谱图中离子相对丰度相比，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在该残留。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50＞20～50＞10～20≤10允许的最大偏差±20±25±30±506.2.3.2定量测定在仪器最佳工作条件下，用青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林标准储备溶液配成的基质混合标准溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林的总离子流图与保留时间见附录B。6.3平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。6.4空白试验除不称取试样外均按上述分析步骤进行。7结果计算从标准工作曲线上得到试样中相应的β-内酰胺类药物浓度后，结果按公式(1)计算：10001000×××=mVcX………………………………………………（1）式中：X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）。DB13/T1384.1—20114c——从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。V——试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）。m——最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。注：计算结果需将空白值扣除。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。DB13/T1384.1—20115AA附录A（资料性附录）参考质谱条件A.1电喷雾电压：5500V。A.２雾化气压力：0.055MPa。A.３气帘气压力：0.079MPa。A.４辅助气流速：6L/min。A.５离子源温度：400℃。A.６去簇电压（DP），聚焦电压（FP）、碰撞能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP），见表A.1。表A.1去簇电压，聚焦电压、碰撞能量及碰撞室出口电压名称定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）碰撞能量v去簇电压v聚焦电压v碰撞室出口电压/v青霉素G335/160335/176335/16020234520011青霉素V351/160351/192351/16020154020011氨苄西林350/192350/160350/16023202020011阿莫西林366/114366/208366/20830192120011DB13/T1384.1—20116BB附录B（资料性附录）四种β－内酰胺类药物标准物质的总离子流图1——阿莫西林，2.49min；2——氨苄西林，9.80min；3——青霉素G，12.70min；4——青霉素V，13.49min。_________________________________