DB13T 1384.5-2011 饲料中庆大霉素的测定

ICS65.120B46DB13河北省地方标准DB13/T1384.5—2011饲料中庆大霉素的测定DeterminationofGentamycininfeed2011-05-10发布2011-05-20实施河北省质量技术监督局发布DB13/T1384.5—2011I前言本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、石家庄市疾病预防控制中心、河北省医科大学、北京出入境检验检疫局技术中心、河北省饲料产品质量监督检验站。本标准主要起草人：张岩、杨立学、李挥、丛斌、卢晓宇、吕品、张宏、贾茜、米振杰、沈磊、范斌、李志平、高振同、武英利。DB13/T1384.5—20111饲料中庆大霉素的测定1范围本标准规定了饲料中庆大霉素的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于饲料中庆大霉素的测定。本标准的方法检出限为20μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682－1992，neqISO3696:1987)3原理试样经提取，高速离心后再用CBX固相萃取小柱净化，液相色谱串联质谱测定，子离子丰度比定性，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。4.2七氟丁酸酐（HFBA）：优级纯。4.3三氯乙酸。4.4磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.5盐酸。4.6二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。4.7样品提取液（10mmol/LKH2PO4溶液，含0.4mmol/LEDTA和2％三氯乙酸）：准确称量1.36gKH2PO4于1000mL容量瓶中，加入少量水，用盐酸调pH至4.0，再加入1.5gNa2EDTA·2H2O和20g三氯乙酸，用水定容至刻度，混匀即得。4.8氢氧化钠。4.9庆大霉素标准品：纯度≥99%。4.10庆大霉素标准储备溶液：分别称取经折算相当于0.0100g新霉素的标准品，用水溶解定容至100mL，溶液浓度为100g/mL。1℃～4℃冷藏保存，保存期1个月。4.11空白样品提取液：用不含链霉素的样品，按照6.1和6.2制备空白样品溶液。4.12庆大霉素标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、300ng/mL的混合标准工作溶液，相当于样品中含有6g/kg、10g/kg、20g/kg、100g/kg、120g/kg新霉素，现配。DB13/T1384.5—201124.13CBX阳离子交换柱，或相当者：500mg，6mL。4.14乙酸。4.1510％乙酸甲醇溶液：准确量取10mL乙酸于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀即可。4.16100mmol/LHFBA水溶液：准确量取6.5mL七氟丁酸酐，用水稀释至500mL（4℃避光保存6个月）。4.1720mmol/LHFBA水溶液：准确量取100mmol/LHFBA溶液50mL，用水稀释至250mL（4℃避光保存6个月）。4.185mmol/LHFBA水溶液：准确量取20mmol/LHFBA溶液25mL，用水稀释至100mL（4℃避光保存6个月）。4.1920mmol/LHFBA乙腈溶液：准确量取1.3mL七氟丁酸酐，用乙腈稀释至500mL（4℃避光保存6个月）。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。5.2微孔滤膜。5.3pH计。5.4高速离心机。5.5旋涡混匀器。5.6固相萃取装置。6测定步骤6.1提取准确称取样品1g（精确到0.01g）至10mL离心管中，加样品提取液10mL，旋涡混匀10min，12000r/min离心10min，移出上清液。重复提取一次，合并上清液，调pH至8.0，12000r/min离心10min，取上清液备用。6.2净化将上清液移入CBX柱（使用前分别用5mL甲醇、5mL水预处理，保持柱体湿润）。溶液以2.0mL/min的流速过柱，然后依次用水淋洗，减压抽干20min。用10%乙酸甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液于40℃下氮气吹干。用5mmol/LHFBA水溶液0.5mL溶解残渣，15000r/min离心10min，经0.22μm滤膜过滤后，待测。6.3测定6.3.1液相色谱-串联质谱条件色谱柱：C18，5μm，50mm×2.lmm（内径）或相当者。流动相：20mmol/LHFBA水溶液（A）+20mmol/LHFBA乙腈溶液（B）。流速：0.25mL/min；梯度：0min～10.0min5%～60%B，10.0min～10.1min60%～5%B，10.1min～15.0min5%B。柱温：30℃。DB13/T1384.5—20113进样量：10μL。离子源：电喷雾离子源。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测。电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。定性离子对(m/z)：478.6/157.1，478.6/322.1。定量离子对(m/z)：478.6/157.1。6.3.2色谱测定根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。庆大霉素标准品多反应监测（MRM）色谱图见附录A。6.4定性、定量按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致，定量测定时采用标准曲线法。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/(％＞50＞20至50＞10至20≤10允许的相对偏差/(％)±20±25±30±506.5空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。7结果计算和表述用色谱数据处理机或用标准曲线按式（1）计算试样中新霉素含量：1000mVcX××=……………………………………………….(1)式中：X一一试样中新霉索的量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c一一从标准曲线上得到的待测液中新霉素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。DB13/T1384.5—20114AA附录A（资料性附录）MRM色谱图图A.1庆大霉素的MRM色谱图_________________________________