DB21T 1861.1-2010 水产生物种质检验技术规程 同工酶

ICS 67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T1861.1—2010水产生物种质检验技术规程同工酶电泳分析法Isozymeproceduretodetectgermplasmforaquaculturespecies2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1861.1 —2010I前  言本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：刘卫东、赫崇波、高祥刚、李云峰、鲍相渤、李宏俊、苏浩。附录A、B、C均为资料性附录。DB21/T1861.1 —20101水产生物种质检验技术规程同工酶电泳法1范围本规程规定了水产动植物同工酶电泳分析所涉及的原理、试剂、仪器、设备、抽样、样品制备、电泳、染色和分析方法等。本规程适用于水产动植物品种内群体酶位点与等位基因分析以及遗传异质性分析。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1同工酶（isozyme）：同工酶是生物体内催化相同反应而一级结构不同的酶。2.2等位基因(allele)：基因的一种变异体。在一个二倍体个体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于父本和母本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。2.3平均遗传杂合度(averageheterozygosity):H表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3原理同工酶是具有同样功效酶基因的表达产物，由于其所带电荷的不同和分子大小、形状的不同，在电场和凝胶中出现各种同工酶组分不同的迁移率，经催化、染色、扫描，根据酶带迁移距离、数目进行分析比较，判定生物物种、种群的遗传特性。4试剂除非另有说明，本规程所设计试剂均为分析纯。4.195%乙醇。4.2甘油。4.3盐酸（HCl）4.4氢氧化钠（NaOH）4.5硼酸。4.6柠檬酸。4.7乙二胺四乙酸（EDTA）。4.8三羟甲基氨基甲烷（Tris）。4.9L-组氨酸。4.10丙烯酰胺（Arc）。DB21/T1861.1 —201024.11乳酸。4.12N’,N’-亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺（Bis）。4.13四甲基乙二胺（TEMED）。4.14过硫酸胺（AP）。4.15DL-苹果酸。4.16α-磷酸甘油钠。4.17磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.18二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。4.19辅酶Ⅰ（NAD）。4.20辅酶Ⅱ(NADP)。4.21吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）。4.22氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。4.23山梨醇。4.24DL-异柠檬酸三钠。4.256-磷酸葡萄糖酸钠。4.26α–乙酸萘酯。4.27β-乙酸萘酯。4.28丙酮。4.29坚牢蓝RR盐。4.30氨基黑10B。4.31固定液：3份乙醇，1份甘油，5份蒸馏水，混合均匀。4.321mol/L盐酸：82.5ml比重1.19的浓盐酸，加蒸馏水至1000ml。4.33浓缩胶缓冲液（Tris-HClpH6.8）：三羟甲基氨基甲烷6.0g溶于40ml蒸馏水中，用1mol/L盐酸调pH值致6.8，定容至100ml。4.34分离胶缓冲液（Tris-HClpH8.8）：三羟甲基氨基甲烷36.3g与48.0ml1mol/L盐酸混合后，蒸馏水定容至100ml。4.35TG电极缓冲液(Tris-甘氨酸pH8.3)：三羟甲基氨基甲烷3.0g与甘氨酸14.4g用蒸馏水溶解并定容至1L。4.36Arc.Bis液：丙烯酰胺30g，N’,N’-亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺0.8g，用蒸馏水溶解并定容到100ml，用0.2μm微孔滤膜抽滤，棕色瓶保存于4℃DB21/T1861.1 —201034.371.5％过硫酸胺：过硫酸胺0.15g溶于10ml蒸馏水中，4℃保存，一周内使用。4.38不连续聚丙烯酰胺凝胶：分离胶的浓度亦为2.5％～4％，浓缩胶的浓度亦为7％～10％。将凝胶模具清洗安装好后，根据所需分离胶浓度，按照附录A配制分离胶并混匀后，立即灌注到凝胶模具中，至胶面离板顶3cm处停止。立即用注射器在胶面顶部注入0.5cm高的蒸馏水，使胶面平整，室温下聚合40min。当水层和分离胶呈现出明显的界限时既表示分离胶聚合完成。排除胶顶部蒸馏水，用浓缩胶缓冲溶液冲洗分离胶顶部并将该缓冲溶液排除，将按照附录B配制的浓缩胶灌入至距板顶3mm处，立即插入试样格（梳子），移除多余的凝胶液，室温下聚合1.5h。4.391.5mol/LTris-HCl(pH8.0)：三羟甲基氨基甲烷181.71g，用HCl调节调节pH值至8.0，蒸馏水定容到1L。4.401.5mol/LTris-HCl(pH9.5)：三羟甲基氨基甲烷181.71g，用HCl调节调节pH值至9.5，蒸馏水定容到1L。4.410.1mol/L磷酸缓冲溶液：二水磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）51.6g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）14.2g，蒸馏水定容至1L。4.4240％的蔗糖溶液：40g蔗糖溶于100ml蒸馏水中。4.431％溴酚蓝：1g溴酚蓝溶于100ml蒸馏水中，定性滤纸过滤后装于滴瓶。4.42染色液：常用同工酶染色液的配置方法见附录C。5仪器与设备5.1微量匀浆机：转速4000r/min。5.2高速冷冻离心机：转速15000r/min以上，冷冻温度为4℃。5.3多用电泳仪。5.4垂直版电泳槽。5.5pH计：读数值0.01.5.6微量进样器。5.7制胶模具。5.8染色缸。5.9低温冰箱，冰室温度在-30℃以下。5.10恒温培养箱。5.11电子天平：感量为0.0001g。5.12照相机。5.13扫描仪。6抽样DB21/T1861.1 —201046.1活体个体的抽样样本应为活体个体，每群体的样本数不得少于30个。6.2取样同工酶不仅具有种的特异性，而且同一个体不同组织，同一组织不同发育阶段都具有特异性，所以取样应采取同一发育阶段的个体的同一组织。组织样品取1~2g，血液样品应分离出血清，所有样品应立即放入低温冰箱中保存。7分析步骤7.1分析样品的制备取0.3g样品，以1份样品加入3份体积的比例加入0.1mol/L磷酸缓冲溶液，于匀浆机内以4000r/min匀浆2min。用吸管将匀浆移入1.5ml离心管中，4℃下以15000r/min离心至上清液澄清。将上清液移入新的离心管中，加入等体40％的蔗糖溶液和1滴1％溴酚蓝溶液，分装在1.5ml离心管中，一75℃下保存备用。7.2凝胶制备凝胶制备按4.38所述方法进行。7.3电泳步骤7.3.1每次电泳前先打开多用恒温循环仪，冷却至4℃左右。7.3.2预电泳：将试样格（梳子）拔出，将凝胶版安装于电泳槽上，将TG电极缓冲液注入上、下电泳槽中，在50mA电流下电泳30min。7.3.3前电泳：预电泳结束后，将点样孔中的残留水分吸干，用微量进样器将10μl～30μl分析样品加到加样孔底部，在25mA电流下电泳10min.7.3.4正式电泳：200V恒压下再电泳4～5h，至溴酚蓝距胶板下沿lcm时停止。7.4染色、脱色和固定7.4.1染色：将凝胶放入预先配制并在37℃恒温箱中保温所需检测酶的染色液中染色。当酶带全部显示清晰时停止染色。7.4.2脱色：在2.5%冰乙酸中脱色至背景清晰透明。7.4.3固定：脱色后的凝胶放入乙醇-冰醋酸-甘油-水的混合液中，其混合比例为3：1：1：5，固定2h或过夜。7.5制干胶片取与凝胶板大小适中的玻璃纸，浸泡湿润后，平铺在凝胶板上，排空气泡，四周向下包紧。于室温下自然风干，制成透明干胶。7.6摄影、扫描用近镜头对凝胶谱带照相，用激光扫描仪对谱带进行扫描。DB21/T1861.1 —201058结果分析8.1酶位点与等位基因分析：根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。8.2群体遗传异质性用多态座位比例（P）和平均杂合度(H)来度量,分别按下式计算：%1001nnPnXHi)1(式中:P——多态座位比例；n1——多态座位数；n——所测基因总座位数；H——平均杂合度；Xi——等位基因i的频率.。DB21/T1861.1 —20106附录A（资料性附录）分离胶的配制比例分离胶浓度（%）a储备溶液7.07.58.08.59.09.510Arc.Bis液（ml）7.07.58.08.59．09.510分离胶缓冲液（ml）21.4620.9420.4419.9419.4418.9418.441.5％过硫酸胺（ml）1.51.51.51.51.51.51.5TEMED（μl）40404040404040注a：凝胶体积为30ml附录B（资料性附录）浓缩胶的配制比例浓缩胶浓度（%）a储备溶液2.533.54Arc.Bis液（ml）0.81.01.21.3浓缩胶缓冲液（ml）0.81.01.21.31.5％过硫酸胺（ml）0.50.50.50.5蒸馏水（ml）7.97.57.16.9TEMED（μl）15151515注a：凝胶体积为10mlDB21/T1861.1 —20107附录C几种常见同工酶的染色配制方法(资料性附录)同工酶染色缓冲液辅酶ⅠNAD(mg)辅酶ⅡNADP(mg)1mg/mlNBT(ml)PMS(mg)其他试剂醇脱氢酶ADH0.25mol/LTris-HClpH8.0,140ml22—10.510.595%乙醇4.5ml酯酶EST0.1mol/L磷酸缓冲液,150ml————α–乙酸萘酯20mgβ-乙酸萘酯20mg丙酮1ml坚牢蓝RR100甘油-3-磷酸脱氢酶α–GPDH0.25mol/LTris-HClpH9.5,114ml45—2110.51mol/L甘油磷酸钠15ml山梨醇脱氢酶SDH0.25mol/LTris-HClpH8.0,140ml22—10.510.5山梨醇3g异柠檬酸脱氢酶IDH1.5mol/LTris-HClpH9.5,15ml—103010.5异柠檬酸钠400mgMgCl2150mg蒸馏水105ml乳酸脱氢酶LDH1.5mol/LTris-HClpH9.5,15ml30—3010.51mol/L乳酸钠10ml蒸馏水95ml苹果酸脱氢酶MDH1.5mol/LTris-HClpH9.5,15ml30—3010.51mol/L苹果酸钠15ml蒸馏水90ml苹果酸酶ME1.5mol/LTris-HClpH8.0,15ml—403010.51mol/L苹果酸钠15ml蒸馏水90ml6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-PGDH0.25mol/LTris-HClpH8.0,140ml—1510.510.56-磷酸葡萄糖酸钠75ml超氧化物歧化酶SOD0.5mol/LTris-HClpH9.5,118ml40—31.531.5—________________________________