DB21T 1861.3-2010 水产生物种质检验技术规程 简单重复序列间区扩增法

ICS 67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T1861.3—2010水产生物种质检验技术规程简单重复序列间区扩增法ISSRproceduretodetectgermplasmforaquaculturespecies2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1861.3 —2010I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：赫崇波，李云峰，刘卫东，高祥刚，李宏俊，鲍相渤。DB21/T1861.3 —20101水产生物种质检验技术规程简单重复序列间区扩增法1范围本标准规定了水产生物简单重复序列间区扩增法（ISSR）的原理、试剂和材料、仪器、采样、分析步骤、数据分析和结果分析。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT18654.15-2008养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2遗传多样性（geneticdiversity）所有生物携带的遗传信息的总和。广义上是指种内或种间，表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传变异度，狭义上则主要是指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度。本标准采用其狭义概念。3.3等位基因（allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.4等位基因频率（allelefrequency）给定座位上某等位基因所占的比例。3.5遗传杂合度（heterozygosity）表示群体在某个座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.6平均遗传杂合度（averageheterozygosity）表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.7多态信息含量（PIC）表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.8DB21/T1861.3 —20102遗传距离（geneticdistance）用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。4原理简单重复序列间区扩增法inter-simplesequencerepeat(ISSR)的基本原理是利用简单重复序列设计引物，即引物主要由1~4个碱基组成的重复序列，通常在引物的3'端或5'端加几个非重复的锚定碱基以保证引物与基因组DNA中的SSR的3′或5′端结合。在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。5试剂和材料5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2三氯甲烷：分析纯。5.3异戊醇：分析纯。5.4无水乙醇。5.520×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA7.44g，加超纯水到1L。5.6冰乙酸：分析纯。5.7琼脂糖：生化试剂。5.8核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9蛋白酶K（20mg/mL）：生化试剂。5.10丙烯酰胺：分析纯。5.11甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12过硫酸铵：分析纯。5.13硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15无水碳酸钠：分析纯。5.16TaqDNA聚合酶（生化试剂，5U/L）。5.17标准分子量Markers（100bp）。5.18硝酸：分析纯。5.1937%甲醛溶液。5.20乙二胺四乙酸（EDTA）。5.2120%凝胶储存液：丙稀酰胺38.6g，双丙稀酰胺1.34g，20×TBE缓冲液10mL，加超纯水到200mL。5.22上样缓冲液：98％甲酰胺，10mMEDTA(pH8.0)，0.01％溴酚蓝及二甲苯青。5.230.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g硫代硫酸钠（Na2S2O3•5H2O）溶于100ml超纯水中。5.24银染液：1g硝酸银溶于1L超纯水中，加入37%甲醛溶液1.5ml。5.25显影液：3g碳酸钠溶于超纯水中，加入37%甲醛溶液1.5ml和0.1mol/L硫代硫酸钠150μl。DB21/T1861.3 —201036仪器6.1凝胶成像分析系统6.2PCR仪6.3低温高速离心机6.5稳压稳流电泳仪6.7单道可调移液器（2.5L，10L，20L，100L，200L，1000L）6.8电子天平（量程0.01-300mg）6.9水浴恒温震荡器6.10电泳槽6.11普通离心机6.12紫外分光光度计6.13超声波清洗器6.14超纯水器6.15北京六一仪器厂DYY-Ⅲ型电泳仪7采样7.1样品类型7.1.1Ⅰ型：毛发、皮毛类（儒艮、中华白海豚、斑海豹、海龟）；7.1.2Ⅱ型：肌肉、肝脏组织类（仿刺参、海胆、虹鳟、大菱鲆、鳗鲡、中国对虾、日本对虾、中华绒鳌蟹、三疣梭子蟹、皱纹盘鲍、海湾扇贝、虾夷扇贝、栉孔扇贝、文蛤、牡蛎、海蜇等）；7.1.3Ⅲ型：藻类（海带、裙带菜、鼠尾藻等）。7.2采样方法7.2.1珍稀濒危动物采样应在自然保护机构、人工养殖部门等协助下进行，以不伤害个体、不破坏其生境为原则，采集其毛发、皮毛等作为样品，特殊情况（如出现受伤个体等）可酌情采取其他部位（如肌肉、肝脏等）。样品数量应不少于10个/群体。所采样品标注后，妥善存放，防止污损，做好采样记录。7.2.2普通水产生物采样随机采取正常、健康个体样品，数量不少于30个/群体。样品标注后，活体运至实验室。8分析步骤8.1样品固定8.1.1Ⅰ型样品DB21/T1861.3 —20104将样品先用70%乙醇洗1次，再用超纯水冲洗2次，-20℃保存备用。8.1.2Ⅱ型样品从活体中直接采集肌肉或脏器组织，-20℃冰箱直接冻存。8.1.3Ⅲ型样品选取幼嫩藻尖，用毛笔在无菌海水中充分刷洗，解剖镜下观察，确定没有附生杂藻后，在无菌蒸馏水中清洗，晾干备用。8.2DNA提取8.2.1Ⅰ型样品在200μL离心管中放入1~4根毛发，毛囊置于离心管底部，剪去高于离心管部分的毛发，设置一个空白对照管；在每个离心管中加入15μL配制好的毛囊裂解液。毛囊裂解液用1×PCR缓冲液(50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl，0.01%明胶)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K20mg/L；在PCR仪上设置一个单循环程序：65℃30min，95℃15min，4℃10min；将上一步骤中的离心管放入预热好的PCR仪中，运行该程序。程序结束后，将离心管进行瞬时离心，-20℃保存备用。8.2.2Ⅱ型样品取-20℃下冻存的脏器0.2g，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，75mmol/LNaCl，0.5%SDS，5mmol/LEDTA)。振荡均匀后，65℃水浴1h；按GB/T18654.15-2008的规定，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用适当50µLTE缓冲液（10mmol/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA）溶解DNA，-20℃保存。8.2.3Ⅲ型样品取鲜样品50~150mg，剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品完全冷冻后，快速、用力研磨至粉末状；将研钵放入65℃水浴至样品粉末刚开始融化，向研钵中加入DNA提取液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，75mmol/LNaCl，0.5％SDS，5mmol/LEDTA)及RNA酶、蛋白酶K共400μL，用力碾磨30s。收集研磨好的组织匀浆移至1.5mL离心管中，65℃保温15~60min，按GBT18654.15-2008的方法，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；水相加入0.1倍体积醋酸钠(3mol/L，pH5.2)和两倍体积无水乙醇沉淀；溶于50µLTE缓冲液(10mmol/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA)，置-20℃保存备用。8.3DNA产物测定8.3.1DNA纯度检测吸取1~3µL提取的DNA，用浓度1~2％琼脂糖凝胶100V电泳30min，检测所提取DNA的质量。以DNA条带的分子量及有无拖尾为标准判断DNA的质量。8.3.2DNA浓度检测8.3.2.1紫外吸收定性测试分别于260nm波长和280nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260／A280比值在1.8~2.0范围内，方可正常进行后续实验。8.3.2.2紫外吸收定量测试DB21/T1861.3 —20105260nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。根据公式(1)计算DNA浓度。DNA浓度(μg/mL)=[A260／(0.020×L)]×稀释倍数…………………………(1)式中：A260－被测样品在260nm下的吸光度值L－比色池厚度，单位cm。DNA浓度在10μg/mL以上，可正常进行后续实验。8.4ISSR分析8.4.1PCR反应按表1配制PCR反应体系，按表2设置程序进行PCR反应表1ISSR-PCR反应体系试剂体积(L)Buffer(10)2.5LMgCl2(25mmol/L)2.0L引物P1A(2pmol/μL)0.5L引物P1B(2pmol/μL)0.5LdNTPs(25mmol/L)0.5LTaqE(5U/L)0.2LDNA(50ng-100ng)3.0L超纯水15.8L表2ISSR-PCR反应程序阶段温度时间194℃5min94℃30s50-60℃30-60s72℃1min225-35个循环372℃10min44℃保存8.4.2凝胶电泳及染色（1）模具处理与安装：清洗用作模具的玻璃板并晾干，并分别涂上亲和硅烷（主板）和剥离硅烷（耳板），安装好边条并加紧模具。（2）6％聚丙烯酰胺凝胶制备：按表3配制6%聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶液灌入模具至胶液距模具上沿0.6cm，将梳子背面插入胶液中，吸出多余胶液，室温下聚合2h。表36%聚丙烯酰胺变性凝胶配制药品与试剂体积20％胶储存液1mL20×TBE缓冲溶液1.5ml超纯水27.2mlDB21/T1861.3 —2010610％过硫酸铵0.3mLTEMED25µL总体积30mL（3）预电泳凝胶聚合后，将梳子正向插入胶顶空处，形成加样孔，连接好电泳设备，添加1×TBE电泳缓冲液，60W恒功率进行预电泳0.5h。（4）与电泳结束后，关闭电源，用注射器吸取电泳缓冲液逐个清洗加样孔。（5）向每管PCR产物中加入10µL上样缓冲液。（5）用微量移液器吸取上述产物，加到上样孔中，每孔上样量为5-8µL。（6）电泳采用恒恒功率电泳，至二甲苯青达整个凝胶的2/3处，停止电泳。（7）银染取下凝板，拆除耳板和边条，将其放入固定液（10%酒精，体积比）中，在摇床上摇动至电泳示踪染料消失。（8）用超纯水漂洗凝胶2-3次，每次1-2分钟。（9）向漂洗过的凝胶中加入2%的硝酸，氧化5分钟。待氧化结束，同样用超纯水漂洗一次，时间2分钟。（10）将凝胶放入银染液，摇动30分钟。（11）用超纯水漂洗5-10秒后，迅速放入准备好的显影液中，缓缓摇动，直到凝胶上出现条带。（12）凝胶置于10％冰醋酸中固定20min，将胶板转入超纯水中清洗3次，每次2min。8.5凝胶图像的获取将上述胶板置于凝胶成像仪中，利用相关图像采集系统得到清晰的电泳凝胶图像，用于结果