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ICS67.040C53备案号：浙江省地方标准DB33DB33DB33DB33DB33/T743-2009水产品中腹泻性贝类毒素残留量的测定液相色谱-串联质谱法DeterminationofDiarrheticShellfishpoisoningresiduesinfisheryproductsHPLC-MS/MSmethod2009-04-07发布2009-05-07实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T743—2009I前言本标准附录A为资料性附录。本标准由浙江省水产标准化委员会提出并归口。本标准起草单位：浙江省水产质量检测中心。本标准主要起草人：张海琪、宋琍琍、施礼科、张晓辉、王扬、郑重莺、郑天伦。DB33/T743—20091水产品中腹泻性贝类毒素残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了水产品中腹泻性贝类毒素大田软海绵酸(Okadaicacid，以下简称OA)和鳍藻毒素-1(Dinophysistoxins-1，以下简称DTX-1)的液相色谱-串联质谱测定法。本标准适用于水产品中腹泻性贝类毒素大田软海绵酸和鳍藻毒素-1残留的测定。本标准腹泻性贝类毒素大田软海绵酸和鳍藻毒素-1的定量限均为0.02mg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T3024腹泻性贝类毒素的测定生物法3原理试样用甲醇和水混合溶液提取，三氯甲烷萃取，硅胶固相萃取柱净化后，液相色谱-串联质谱确证并定性，外标法定量。4试剂和材料4.1水：GB/T6682规定的一级水。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4丙酮：分析纯。4.5正己烷：分析纯。4.6三氯甲烷：分析纯。4.7乙酸：优质纯。4.820%正己烷丙酮溶液：移取200mL正己烷，用丙酮定容至1L。4.93%甲醇丙酮溶液：移取30mL甲醇，用丙酮定容至1L。4.1040%甲醇丙酮溶液：移取400mL甲醇，用丙酮定容至1L。4.1180%甲醇水溶液：移取800mL甲醇，用水定容至1L。4.12大田软海绵酸标准品（CAS号：78111-17-8，分子式：C44H68O13）：纯度大于97.5%。4.13鳍藻毒素-1标准品（CAS号：81720-10-7，分子式：C45H70O13）：纯度大于90%。4.14标准储备溶液：分别称取经折算相当于0.00100g的标准物质（4.12和4.13）于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，使各自的浓度均为10μg/mL，避光4℃保存。4.15空白样品提取液：用不含腹泻性贝类毒素的水产品，按照6.2和6.3制备空白样品溶液。4.16标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备溶液稀释成20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL的混合标准工作溶液，相当于样品中含有0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg大田软海绵酸和鳍藻毒素-1，现配。4.17硅胶固相萃取柱：500mg，3mL，或相当者。DB33/T743—200925仪器5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。5.2电子天平：感量为0.00001g和0.01g。5.3组织捣碎机。5.4高速匀浆机：20000r/min。5.5涡旋混合器。5.6超声波发生器。5.7固相萃取装置。5.8高速离心机：10000r/min。5.9氮气吹干仪。5.10移液器：规格为20μL~200μL和50μL~1mL。6测定步骤6.1试样6.1.1取样按SC/T3024中第5章进行取样。6.1.2试样制备与保存试样用组织捣碎机捣碎后，再用高速匀浆机匀浆，四分法制样。一份用作检测，另一份用作备样，保存于-20℃冰箱中。6.2提取称取试样2g（精确到0.01g），置于洁净的离心管中，加入80%甲醇水溶液（4.11）10mL，超声提取5min后，6000r/min离心10min。重复提取一次，合并上层液，用80%甲醇水溶液定容至25mL。取二分之一的定容液于另一离心管中，加入5mL正己烷，涡旋混匀，分层，弃去正己烷层，加入1mL水和6mL三氯甲烷，涡旋混匀，分层，吸取水相于另一离心管中，用6mL三氯甲烷重复萃取二次，合并三氯甲烷层，于60℃水浴氮气吹干仪中用氮气流吹至近干。残余物用1mL20%正己烷丙酮溶液（4.8）溶解，待净化。6.3净化依次用10mL丙酮、10mL甲醇和10mL20%正己烷丙酮溶液（4.8）活化固相萃取柱，然后注入提取液（6.2），然后分别用lmL20%正己烷丙酮溶液（4.8）和10mL3%甲醇丙酮溶液（4.9）淋洗。抽干5min后，用10mL40%甲醇丙酮溶液（4.10）进行洗脱，收集洗脱液于45℃水浴、氮气流中吹干。残余物用1.0mL80%甲醇水溶液（4.11）溶解，混匀，供测试。6.4测定6.4.1液相色谱条件6.4.1.1色谱柱：C18柱，150mm×2.1mm（i.d.），5μm，或相当者；6.4.1.2柱温：30℃；6.4.1.3进样量：10μL；6.4.1.4流动相：0.1%乙酸水溶液：乙腈（30：70，体积比）；6.4.1.5流速为250μL/min。6.4.2质谱条件6.4.2.1离子源：电喷雾离子源（ESI）；6.4.2.2扫描方式：负离子扫描；6.4.2.3检测方式：多反应监测（MRM）；6.4.2.4离子源温度：500℃；DB33/T743—200936.4.2.5雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；6.4.2.6喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；6.4.2.7定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表1。表12种腹泻性贝类毒素的质谱参数6.4.3液相色谱-串联质谱测定根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得到标准曲线回归方程。标准工作液和样液待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下，OA和DTX-1的参考保留时间分别约为3.4min和5.7min，2种腹泻性贝类毒素的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A。外标法定量，超出线性范围则应稀释后再进样分析。6.4.4定性判定在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与标准溶液谱图中定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差6.4.5空白实验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。7结果计算样品中OA或DTX-1贝类毒素的残留含用色谱数据处理机或用标准曲线按式（1）进行计算。……………………………………（1）10001000××=mVcX式中：──样品中OA或DTX-1贝类毒素残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；Xc──测试液中OA或DTX-1贝类毒素的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V──样品定容体积，单位为毫升（mL）；m──测试液所代表样品的质量，单位为克（g）。8方法回收率在0.02mg/kg~1.6mg/kg浓度范围内，回收率在75%～110%之间。9方法定量限本方法的OA和DTX-1的定量限均为0.02mg/kg。毒素名称英文名称缩写定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）去簇电压DP（V）碰撞能量CE（V）大田软海绵酸OkadaicacidOA803.6/255.0803.6/563.4803.6/255.0-70-70-60-68鳍藻毒素-1Dinophysistoxins-1DTX-1817.4/255.0817.4/113.1817.4/255.0-110-110-68-94相对离子丰度（%）＞50＞20~50＞10~20≤10允许的相对偏差（%）±20±25±30±50DB33/T743—2009410允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。DB33/T743—20095附录A（资料性附录）腹泻性贝类毒素多反应监测（MRM）色谱图图A.1OA、DTX-1腹泻性贝类毒素的多反应监测（MRM）色谱图（OA的保留时间3.4min，定性离子对m/z803.6/255.0和m/z803.6/563.4；DTX-1的保留时间5.7min，定性离子对m/z817.4/255.0和m/z817.4/113.1）