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ICS67.040C53备案号：浙江省地方标准DB33DB33DB33DB33DB33/T744—2009水产品中呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物的快速测定酶联免疫法Rapiddeterminationoffurazolidoneandfuraltadonemetaboliteresiduesinaquaticproducts－Enzymelinkedimmunosorbentassaymethod2009-04-07发布2009-05-07实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T744—2009I前言本标准由浙江省水产标准技术委员会提出并归口。本标准起草单位：浙江省水产质量检测中心。本标准主要起草人：张晓辉、宋琍琍、张海琪、王扬、孔蕾。DB33/T744—20091水产品中呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物的快速测定酶联免疫法1范围本标准规定了水产品中呋喃唑酮代谢物（3-amina-2-oxazolldinone，AOZ）和呋喃它酮代谢物（AMOZ）残留量的酶联免疫快速测定方法。本标准适用于水产品中AOZ和AMOZ残留量的检验，本标准AOZ和AMOZ的检出限均为0.50µg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T3016－2004水产品抽样办法3原理测定的基础是抗原抗体特异性反应，微孔板包被有针对被测物抗体的抗体，加入被测物抗体、酶标记物、标准或样品溶液于板孔中，游离的被测物与酶标记物竞争抗体结合位点，同时被测物抗体也与微孔板上固定的抗体结合，没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去，然后将显色剂加入到板孔中并孵育，结合的酶标记物可以将无色的显色剂转化为蓝色产物，加入反应终止液后，在450nm处测量吸光度，吸光度值与被测物浓度成反比。4试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂。4.1水：应符合GB/T6682规定的一级水。4.2乙酸乙酯：色谱纯。4.3磷酸氢二钾。4.4正己烷。4.5二甲亚砜：优级纯。4.6盐酸。4.7氢氧化钠。4.82-硝基苯甲醛（2-NBA）：纯度≥99%。4.9磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：称取2.28g磷酸氢二钾（4.3），用水溶解，定容至100mL。4.10盐酸溶液（1.0mol/L）：量取8.3mL盐酸（4.6），用水定容至100mL。4.11氢氧化钠溶液（1.0mol/L）：称取4.0g氢氧化钠(4.7)，用水溶解，定容至100mL。4.122-硝基苯甲醛溶液（10.0mmol/L）：称取15.2mg2-硝基苯甲醛（4.8），溶于10mL二甲亚砜(4.5)，临用前配制。DB33/T744—200924.13试剂盒提供试剂包括：抗体预包被的96孔板，AOZ/AMOZ标准溶液、AOZ/AMOZ抗体、底物/显色剂、酶标记物、反应终止液，洗涤缓冲液和样品稀释液用时直接溶于1000mL蒸馏水中即可。5仪器与设备5.1电子天平：感量0.01g和0.0001g。5.2组织捣碎机。5.3恒温振荡器。5.4旋转混合器。5.5台式离心机：5000rmp。5.6氮气吹干仪。5.75μL～50μL、50μL～200μL、100μL～1000μL微量加液体器。6样品分析6.1制备与保存6.1.1抽样：按SC/T3016－2004的规定执行。6.1.2样品经处理后，取可食部分100g，用组织捣碎机捣碎，装入干净容器，标明标记，于－18℃冰柜中冷冻保存。6.1.3苗种样品直接用组织捣碎机捣碎，再装入干净容器，标明标记，于－18℃冰柜中冷冻保存。6.2提取与纯化称取1.00g样品，分别加入4.0mL蒸馏水(4.1)、0.5mL盐酸溶液（4.10）和100uL2-硝基苯甲醛溶液（4.12），充分振荡，37℃振荡16小时以上，分别加入5.0mL磷酸氢二钾溶液(4.9)、0.4mL氢氧化钠溶液（4.11）和5.0mL乙酸乙酯(4.2)，剧烈振荡30秒钟，用盐酸溶液（4.10）和氢氧化钠溶液（4.11）调节溶液PH至7.0附近，室温下离心10min，转移乙酸乙酯层到另一个新容器，再加入5.0ml乙酸乙酯，重复操作一次，合并乙酸乙酯层，45℃条件下氮气吹干，用1.0mL正己烷（4.4）溶解干燥物，再用1.0mL样品稀释液（4.13）适当混合，室温下离心10min，取50uL下层液体进行分析。对脂肪含量高的样品，可以重复多次去脂肪；对实测结果在标准曲线线性范围之外的，可以将样品液稀释处理。6.3测定6.3.1将足够标准和样品所用数量孔条插入微孔架，记录下标准和样品的位置。6.3.2加入50uL标准液和处理好的试样液到各自微孔中，每个微孔加入试样液和标准液时需要更换移液器吸头。6.3.3加入50uL酶标记物溶液到每一个微孔底部，充分混合。6.3.4加入50uL抗体溶液到每一个微孔底部，充分混合，25℃条件下暗处孵育1小时。6.3.5倒出微孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去微孔中的液体，用250uL样品洗涤缓冲液(4.13)充入孔中，倒掉微孔中液体。重复上述操作两次。6.3.6加入100uL基质/发色试剂到每一微孔中，充分混合并在25℃条件下暗处孵育15分钟。6.3.7加入100uL反应终止液到每一微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值（注意：加入停止液后60min内读取吸光度值）。7结果计算7.1计算百分比计算每个AOZ/AMOZ标准和样品吸光度值，按公式（1）计算，求得AOZ/AMOZ标准和样品的百分比吸光度值：DB33/T744—20093……………………………………………（1）0%AAE=式中：E——百分比吸光度值，％；A——标准液或试样液吸光度值；A0——0标准吸光度值。以百分比吸光度值为纵坐标，以AOZ/AMOZ标准液浓度对数值为横坐标，建立标准曲线。从标准曲线上读取待测液百分比吸光度值所对应的AOZ/AMOZ浓度，即为样品中AOZ/AMOZ浓度。8方法检测限、准确度和精密度8.1方法检测限本方法在水产品中AOZ/AMOZ检测限均为0.50µg/kg。8.2准确度本方法在0.50µg/kg～3.0µg/kg添加浓度的平均回收率在80％～110％之间。8.3精密度本方法的相对标准偏差RSD小于20%。