免疫定性项目性能验证

临床免疫定性检测的性能验证高速列车性能验证空气动力学速度车体转向架运行固定、悬挂的零部件强度稳定性舒适感故障率……第3页测定系统方法学操作程序校准品仪器试剂测定系统的关键要素医学检验为什么需要“性能验证”？评价检测系统是否满足临床检测和认可组织的要求（ISO15189）；验证厂家提供的试剂参数能否在本实验室得到重现。什么时候进行性能验证使用新的检测试剂或系统时；更换检测试剂或系统时。更换新的试剂或系统意义：更易于操作更高的检测性能更经济更能满足实验室测定要求一.定性临床应用与分类1、定性测定的临床应用免疫学测定：感染性疾病、肿瘤标志物核酸和基因检测微生物检验细胞学检验寄生虫检验2、定性实验的临床分类筛查实验：如便潜血、TP诊断实验：如微生物学培养与细菌鉴定确认实验：对以上已做出的检验结果进行验证和确认3.几个重要概念筛查试验：临床上筛查方法通常用于检测整个人群（或者人群中的特定部分）中特定指标的情况。例如对需输血患者样本做HIV血清学试验。一般来说，这些用于筛查的定性试验必须具有高敏感性以确保真阳性结果的检出。如果筛查试验的假阳性结果所造成的社会及经济后果不是非常严重，这种低特异性可通过特异性较好的确认试验加以弥补。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline3.几个重要概念诊断试验：通常用于临床怀疑某种特定疾病或状况是否存在的诊断性定性试验。例如各种微生物培养就是用于检查感染情况的诊断试验。临床上对治疗的要求，诊断试验应具有很好的敏感性和特异性。如果诊断试验后还进行确认试验，那么诊断试验的特异性要求可以稍微降低。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline3.几个重要概念确认试验：确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果。如果确诊试验证实了之前的检测结果，临床医生即可作出诊断。确认试验通过设计使其具有较高的特异性（有时甚至以牺牲敏感性为代价）以及高阳性预测值。免疫印迹试验就是一种用于HIV血清学试验等筛查试验之后的确认试验。3.几个重要概念敏感性或阳性测定能力指数（DI（＋））：可定义为一实验对阳性标本测定后给出阳性结果的能力。DI（＋）=[真阳性/（真阳性+假阴性）]×100%特异性或阴性测定能力指数（DI（－））：则为对阴性样本测定给出阴性结果的能力DI（－）=[真阴性/（真阴性+假阳性）]×100%3.几个重要概念阳性预示值：即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。=[真阳性/（真阳性+假阳性）]×100%阴性预示值:则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。=[真阴性/（真阴性+假阴性）]×100%临床诊断（金标准）总计阳性阴性验证方法阳性ABA+B阴性CDC+D总计A+CB+DN敏感度=100%×[A/（A+C）]特异性=100%×[D/（B+D）]相关样本的患病率=100%×[（A+C）/N]阳性预测值（PVP）=100%×[A/（A+B）]阴性预测值（PVN）=100%×[D/（C+D）]方法效率（正确率）=100%×[（A+D）/N]“预示值”对临床检验结果影响预示值对一个有95%敏感性和95%特异性的试剂检测结果的影响（100,000人）结果10%感染率1%感染率检出(+)未检出(－)检出(+)未检出(－)+9,50050095050－4,50085,5004,95094,050敏感性(TP/[TP+FN])95%95%特异性(TN/[TN+FP])95%95%阳性预示值TP/[TP+FP]9500/[9500+4500]=67.9%950/[950+4950]=16%阴性预示值TN/[TN+FN]85500/[85500+500]=99.4%94050/[94050+50]=99.9%二.定性检测系统的性能验证验证的内容:1.正确度（准确度）2.精密度3.敏感性4.特异性5.CUTOFF值验证6.其他（需要时）EP15A2EP17AEP12ClinicalLaboratoryandStandardsInstitute(CLSI)涉及免疫定性检测评价方法标准医学实验室精密度和准确度的确认检出限与定量限的评价定性检测评价临床实验室标准化协会性能验证前的准备应熟悉待验证的试剂或系统进行必要的培训，包括样本的处理和储存、试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结果合理的解释以及系统的质量控制等。制定质量保证计划确定患者样本的数量及强弱（评价重复性）确定比较的方法CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline性能验证的合格标准从何而来？试剂盒说明书国际和／或国际标准性能验证前样本的准备质控品：使用商品化质控物进行，包括阴性和阳性。样本的采集和保存：采集时间、保存方式等必须保证一致性。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline方法比较用样本数量取决于评价者的目的。作为最低要求，检测要持续到至少用比较方法获得50个阳性样本。并且至少用比较方法获得50例阴性样本以确定此种检测方法的特异性。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline1.准确度验证1）检测已知值的参考物质室间质评材料(卫生部或者CAP)厂商提供的已赋值的参考材料分析用参考方法或决定方法定值的材料。2）方法比较试验：样本数为10-20个，两种方法同时测定同样的样品，用KAPPA检验方法分析两种方法检测结果一致性.(比如HBV酶免法和发光法比对)选取40份（20份）样本,最好阴阳性各半↓随机盲法重新分号↓检测样本↓将所有检测结果汇总填表↓计算评价性能指标2.精密度验证1）批内精密度:同一份样本在同一批次内平行重复检测10次.然后计算均值,SD和CV.2）批间精密度:同一份样本连续检测10天,每天平行检测双孔.然后计算均值,SD和CV.Note:用S/CO比值进行统计计算.最好选择临界值,或弱阳性样本.判断标准:批内CV小于15%,批间CV小于25%.批内重复性的验证高、中、低三个浓度的样本，在一批检测内，重复检测20次（孔），计算所得S/CO值的均值和SD，计算批内CV%。判断结论：应≤试剂说明书所标明的批内变异。ELISA的批内变异CV%应≤10%。批间重复性的验证高、中、低三个浓度的样本，在10天以上时间内单次（孔或管）重复进行20批检测，计算所得S/CO值的均值和SD，计算批间CV%。判断结论：应≤试剂说明书所标明的批间变异。ELISA的批间变异CV%应≤15%。3.敏感性1）验证方法:取10-20份已知真阳性的样本，用常规检测方法检测，计算检测阳性的样本占样本总数的比例。2）样本来源:临床诊断的阳性病人血清；厂家提供的阳性对照；决定性参考方法检测阳性的样本；以上阳性样本来源紧张时，可以进行稀释（如2：3，3：4这样稀释）4.特异性1）验证方法：选取20份正常健康人血清（一般取自健康体检者），计算其检测阴性结果所占百分率。2）样本来源:体检样本,体检者确认符合要求后即可.NOTE:部分项目在健康体检人群中阳性率也很高,此类项目特异性验证很难执行,建议引用厂家说明书.比如麻疹病毒IgG,CP-IgG,MP-IgG等一系列病毒抗体IgG.因为很难确认体检者既往是否有过感染史,而IgG抗体在体内存留时间长.因此很难收集到真正意义上的阴性样本.特异性验证（干扰）特定病原体以外感染性疾病患者的样本。含有干扰性物质的样本：类风湿因子（RF）阳性、含异嗜性抗体、溶血、脂血、高胆红素样本。结果判断：非特定病原体感染患者样本均应为阴性。含一定浓度干扰物质的样本检测应为阴性。5.CUT-OFF重复性和测定下限验证CUT-OFF重复性验证：样本浓度应接近临界值。不宜用阴性或强阳性样本。批内和批间变异验证：高、中和低三个浓度（与试剂盒说明书中所述相适应）临界点的定义同样一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline临界点（CUT-OFF)与试剂盒判断值（CUT-OFF值）的区别这里的临界点指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓度，其一旦确定，是不变的。试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号值，每次测定都会有所差异。(1)CUT-OFF重复性验证CUT-OFF的重复性（同时包含测定下限的验证）批内变异的验证批间变异的验证验证步骤制备足够40次重复检测的3份样本：分别为处于临界浓度、高于临界浓度20%和低于临界浓度20%的样本。重复检测样本40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。评价临界浓度是否准确？评价+20至-20%的浓度范围是否包含于、位于或者超出这种方法的95%区间？CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuidelineC50是否准确？40次测试C501阳性结果=13/40(32.5%)不正确=27/40(67.5%)2阳性结果（14-26）/40（35%-65%）正确阳性结果重复性检测总次数次数百分比真正百分比样本的实际浓度201050%30%-70%C30-C70402050%35%-65%1005050%40%-60%不同C50重复检测次数与检出阳性数的关系临界点（CUT-OFF）的重复性指的是什么？是为正在评价的检测试剂或系统建立分析物的临界浓度(C50)，并且确保临界浓度±20%的范围处于95%区间内。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline如何获得系统或试剂的“临界点”检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度。如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50%阳性和50%阴性结果的那个稀释度。这一稀释度的分析物浓度即为临界点。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline(2)测定下限的验证处于测定下限浓度（如临界点浓度+20%）的样本，重复检测20次，应至少有18次以上(90%)为阳性反应。重复性验证的质量控制质控品：如方法学比较在10天内完成，则每一批次都要进行质控样本检测，如出现失控，则当次检测结果无效。安排重新检测以替换不合格的批次。实验室要分析失控的原因。不合格批次在10天内不应超过1次或20天内不超过两次。如若超出，所在实验室应中止检测工作并咨询试剂制造商以确定原因并采取纠正措施。得出20次重复检测结果。如果方法比较研究超过20天，则每一批次对每份对照样本进行单次检测，总计也提供20次结果。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline6.其他（1）同一项目不同检测方法或仪器的比对适用范围:一个项目有两种以上的方法或者两台以上的仪器(