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ICS65.020B15中华人民共和国农业行业标准NY/T2059—2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法Technicalspecificationforthedetectionofricestripevirusinsmallbrownplanthopper—Dotimmunobindingassay2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T2059—2011前言本标准按照GB／T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：周益军、周彤、范永坚、程兆榜。ⅠNY/T2059—2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法1范围本标准规定了灰飞虱携带水稻条纹免疫斑点检测方法。本标准适用于灰飞虱携带水稻条纹病毒的检测。2原理硝酸纤维素膜在中性条件下有效地吸附生物大分子，将抗原吸附于硝酸纤维素膜后，进行抗原抗体反应，当抗体与膜上的抗原结合后，通过再次结合有标记的抗抗体，经底物作用使斑点着色。3试剂除非另有说明，均使用分析纯试剂，水为蒸馏水。3.1碳酸钠(Na2CO3)3.2碳酸氢钠(NaHCO3)3.3氯化钠(NaCI)3.4氯化钾(KCI)3.5磷酸二氢钾(KH2PO4)3.6磷酸氧二钠(Na2HPO4)3.7盐酸(HCI)3.8无水乙醇(EaOH)3.9过氧化氢(H2O2)3.104-氯-1-萘酚3.11吐温20（Tween-20）3.12脱脂奶粉3.13小牛血清蛋白(BSA)3.14辣根过氧化物酶3.15磷酸盐缓冲液(0.02mol／L)：准确称取40.00g氯化钠(3.3)、1.00g氯化钾(3.4)、1.00g磷酸二氢钾(3.5)和15.00g磷酸氢二钠(3.6)于2500mL的容量瓶中加水定容至刻度，用盐酸(3.7)调节pH至7.5，4℃保存：3.16磷酸盐吐温20缓冲液(0.01mol／L)：准确称取40.00g氯化钠(3.3)，1.00g氯化钾(3.4)、1.00g磷酸二氢钾(3.5)和15.00915.00g磷酸氢二钠(3.6)于5000mL的容量瓶中加水定容至刻度，用盐酸(3.7)调节pH至7.5，再加入2.5mL吐温20(3.11)，4℃保存。3.17包被缓冲液(0.05mol／L)：准确称取1.59g碳酸钠(3.1)和2.93g碳酸氢钠(3.2)于1000mL的容量瓶中加水定容至刻度，用盐酸(3.7)调节pH至9.6，4℃保存。3.181%脱脂奶粉封闭液：准确称取1.00g脱脂奶粉(3.12)加入100mL磷酸盐吐温20缓冲液(3.16)，混匀后4℃保存。3.192%小牛血清蛋白封闭液：准确称取0.2g小牛血清蛋白(3.13)加入100mL磷酸盐吐温20缓冲液(3.16)，混匀后4℃保存。1NY/T2059—20113.20辣根过氧化物酶固体显色底物溶液：准确称取6.00mg4-氯-1-萘酚(3.10)，于2mL无水乙醇(3.8)中，4℃保存备用，使用时加入10mL磷酸盐缓冲液(3.15)，再加入10µL过氧化氢(3.9)。3.21单抗：效价为1：10000，-18'C保存。3.22二抗：效价为1：5000，-18℃保存。4仪器设备4.1台式离心机。4.2加盖塑料离心管：200µL。4.3恒温摇床。4.4玻璃培养皿。4.5塑料盒：长100mm、宽50mm、高度10mm～50mm。4.6硝酸纤维素膜。5标准程序5.1灰飞虱的准备选择2龄以上单头灰飞虱置于离心管中，用牙签捣碎后加100µL包被缓冲液，离心(5000r／min)3min，取上清液（灰飞虱提取液）备用。5.2封闭预先用铅笔将硝酸纤维素膜划成5mm×5mm的正方格，取3µL灰飞虱提取液点于硝酸纤维素膜中央（以不超出正方格一半为准），同时取3µL提纯的水稻条纹病毒（也可用已采用本方法测定为阳性的带毒灰飞虱提取液）和3µL的蒸馏水分别点于硝酸纤维素膜上预先标记好的正方格内，分别作为阳性对照和阴性对照，室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养皿中，再加入1%脱脂奶粉或2%小牛血清蛋白封闭液至膜完全浸没，于37℃摇床上摇晃30min。5.3孵育将水稻条纹病毒单克隆抗体和封闭液按比例(1：20000～1：40000)配制孵育液，弃去封闭液后将膜完全浸入孵育液，于37℃摇床上孵育1h～l.5h，弃去孵育液，再加入磷酸盐Tween-20缓冲液(3.16)，将膜完全浸没于摇床上摇晃3min～5min，倒弃洗液，并重复洗膜3次。5.4二抗孵育倒弃洗液，以辣根过氧化物酶(3.14)标记的二抗和封闭液按比例(1：2500)配制孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液，于37℃摇床上孵育1.5h～2h。倒弃二抗孵育液，加入磷酸盐Tween-20缓冲液，至膜完全浸没，再于摇床上洗膜3min～5min，倒弃洗液，并重复洗膜3次。5.5显色向倒弃洗液的膜加入辣根过氧化物酶固体显色液至完全浸没，室温下静置显色30min，用蒸馏水冲洗膜1次～2次，室温晾干。5.6结果显色后观察对照的颜色反应,阳性对照应显蓝紫色，阴性对照应不显色，若待测样呈蓝紫色，确认该头灰飞虱携带水稻条纹病毒；若不显色，则确认该头灰飞虱不携带水稻条纹病毒；若出现阳性对照不显色或阴性对照显蓝紫色中任一者，则应重新检测。试验结果记录格式见表1。2NY/T2059—2011表1灰飞虱携带水稻条纹病毒结果记录表样品采集日期样品采集地点灰飞虱代次测定样品数量，头阳性样品数，头阴性样品数，头带毒率%鉴定技术负责人6简化程序6.1灰飞虱的准备选择2龄以上单头灰飞虱置于离心管中，用牙签捣碎后加100µL包被缓冲液摇匀，取上清液（灰飞虱提取液）备用。6.2封闭预先用铅笔将硝酸纤维素膜(NC)划成5mm×5mm的正方格，用牙签蘸少许灰飞虱提取液点于硝酸纤维素膜中央（以不超出正方格一半为准）；同时用牙签蘸少许提纯的水稻条纹病毒（也可用已采用本方法测定为阳性的带毒灰飞虱提取液）和蒸馏水点于膜上预先标记好的正方格内，分别作为阳性对照和阴性对照，室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养皿中，再加入1%脱脂奶粉或2%小牛血清蛋白封闭液至膜完全浸没，室温条件下(15℃～30℃)轻轻摇晃，封闭60min。6.3孵育将水稻条纹病毒单克隆抗体和封闭液按比例(1﹕20000～1﹕40000)配制孵育液，弃去封闭液后将膜完全浸入孵育液，室温条件下轻轻摇晃孵育3h，弃去孵育液，再加入磷酸盐Tween-20缓冲液(3.16)，将膜完全浸没于用手轻轻摇晃3min～5min，倒弃洗液，并重复洗膜3次。6.4二抗孵育倒弃洗液，以辣根过氧化物酶(3.14)标记的二抗和封闭液按比例(1﹕2500)配制孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液，室温条件下轻轻摇晃孵育3h。倒弃二抗孵育液,加入磷酸盐Tween-20缓冲液，至膜完全浸没，再轻轻摇晃洗膜3min～5min，倒弃洗液，并重复洗膜3次。6.5显色向倒弃洗液的膜加入辣根过氧化物酶固体显色液至完全浸没，室温下静置显色1h～2h。以蒸馏水冲洗膜，室温晾干。6.6结果显色后观察对照的颜色反应，阳性对照应显蓝紫色,阴性对照应不显色，若待测样呈蓝紫色，确认该头灰飞虱携带水稻条纹病毒；若不显色，则确认该头灰飞虱不携带水稻条纹病毒；若出现阳性对照不显色或阴性对照显蓝紫色中任一者，则应重新检测。试验结果记录同表1。3