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ICSDB34备案号：安徽省地方标准DB34/T821—2008动物组织中氯霉素的残留测定——酶联免疫吸附法2008-08-01发布2008-08-01实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T821—2008I前言本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省质量技术监督局批准。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽省畜产品质量安全检测中心。本标准起草人：许世富、汤春莲、明文庆、张莉。本标准于2008年8月1日首次发布。DB34/T821—20081动物组织中氯霉素的残留测定——酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物肌肉、肝脏、肾脏中氯霉素检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏中氯霉素的残留快速测定。本方法在动物肌肉、肝脏、肾脏中的检测限为0.1μg/kg，线性范围：0.0025ng～0.2025ng。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试样制备动物肌肉、肝脏、肾脏，去筋后切成小块，制成肉糜后，于－18℃以下温度冷冻保存。4原理动物组织中残留的氯霉素经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂后用于酶联免疫测定。本测定方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：吸附在孔内的氯霉素与标准或样品中的氯霉素竞争性地与氯霉素抗体相结合，与标准品或样品相结合的氯霉素抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，其再与加入的酶标记的第二抗体相结合，酶底物在酶作用下产生发色物，在一定浓度范围内吸光度的高低与样品中氯霉素的含量成反比。5试剂和溶液5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级水的规定。5.2竞争酶标免疫法氯霉素试剂盒，2℃～8℃冰箱中保存。5.2.1微孔板：包被有氯霉素抗体。5.2.2氯霉素标准溶液：浓度范围0.05μg/L～4.05μg/L。5.2.3酶标记物。5.2.4氯霉素抗体浓缩液。5.2.5底物A。5.2.6底物B。5.2.7终止液。5.2.8样品稀释缓冲液。5.2.9浓缩洗涤液。5.2.10浓缩复溶液。5.3洗涤液：用水20倍稀释厂商提供的浓缩洗涤液。5.4复溶液：用水2倍稀释厂商提供的浓缩复溶液。5.5乙酸乙酯。DB34/T821—200825.6正己烷。6仪器设备6.1酶标仪（带450nm滤光片）。6.2振荡器。6.3匀浆机。6.4冷冻离心机。6.5冰箱。6.6生化培养箱。6.7氮吹仪。6.8分析天平：感量0.01g。6.9微量加样器及配套吸头：（单道20μL，50μL，100μL，多道50μL～300μL）。7测定步骤7.1样品处理称取3±0.1g匀质后样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，振荡10min，室温4000g离心10min。取4mL上层样品，60℃水浴氮气吹干，残留物用1mL正己烷溶解，再加入试剂盒提供的复溶液1mL。振荡1min，4000g离心5min，去除上层有机相，取50μL下层水相进行测定。7.2测试程序7.2.1测定在室温20℃～25℃条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20℃～25℃）下放置1h～2h。7.2.2将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。7.2.3分别在各孔中加50µL的标准品溶液或样品溶液，然后每孔加50μL抗体，用盖板膜封板，20℃～25℃反应1h，倾出微孔中的液体，在所有微孔中加250μL洗涤液，轻轻振荡混匀，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板4遍。7.2.4每孔加100μL酶标记物，用盖板膜封板板，20℃～25℃反应30min。7.2.5将微孔内液体倾出，加250μL洗涤液，轻轻振荡混匀，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板4遍。7.2.6每孔加50μL底物A，再加50μL底物B，轻轻振荡混匀，37℃避光反应15min。7.2.7每孔加50μL终止液，轻轻振荡混匀，30min内在450nm下检测吸光度。8结果判定和表述按下式计算百分吸光度值：百分吸光度值=0BB×100％…………………………………………………………（1）式中：B——为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；Bo——为零标准的标准溶液平均吸光度值。用专业计算机软件求出供试样品中氯霉素的浓度，乘以稀释系数即得检测结果。或计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度（ng/L）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在50～4050ng/L范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/L）可以从校正曲线上读出。9检测方法灵敏度、准确度、精密度DB34/T821—200839.1灵敏度本方法在动物组织中的检测限为0.1μg/kg。9.2准确度本方法在0.3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～120％。9.3精密度本方法的批内变异系数CV％≤10％，批间变异系数CV％≤15％。10其他10.1本方法动物组织稀释系数为0.5。10.2本方法为快速测定法，检测结果小于0.1μg/kg时可判为未检出，大于0.1μg/kg时需用气相色－质谱法（GC/MS）或液相色谱－质谱法（LC/MS/MS）确认。10.3B0吸光值不得低于0.8。10.4试剂盒可能存在交叉反应，不同品牌的试剂盒，其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。