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ICSDB34备案号：安徽省地方标准DB34/T822—2008动物组织中地西泮的残留测定——酶联免疫吸附法2008-08-01发布2008-08-01实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T822—2008I前言本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省质量技术监督局批准。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽省畜产品质量安全检测中心。本标准起草人：许世富、陶小平、刘红云、汤春莲。本标准于2008年8月1日首次发布。DB34/T822—20081动物组织中地西泮的残留测定——酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物肌肉、肝脏、肾脏中地西泮检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏中地西泮的残留快速测定。本方法在动物肌肉、肝脏、肾脏中的检测限为1.5μg/kg，线性范围：0.0075ng～0.25ng。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试样制备动物肌肉、肝脏、肾脏，去筋后切成小块，制成肉糜后，于－18℃以下温度冷冻保存。4原理残留在组织中的地西泮经样品提取液提取后，用于酶联免疫分析。测定方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：吸附在孔内的地西泮与标准或样品中的地西泮竞争性地与地西泮抗体相结合，与标准品或样品相结合的地西泮抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，加入一定量的显色底物，酶的颜色变成蓝色，加入终止液后颜色由蓝色变成黄色。在450nm处进行吸光度测量，换算后可以获得样本中地西泮的浓度含量，在一定浓度范围内吸光度的高低与样品中地西泮的含量成反比。5试剂和溶液5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级水的规定。5.2竞争酶标免疫法地西泮检测试剂盒2℃～8℃冰箱中保存。5.2.1微孔板：包被有地西泮抗体。5.2.2地西泮标准溶液，0.1μg/mL。5.2.3酶标物冻干粉。5.2.4酶标物溶解液。5.2.5浓缩稀释液。5.2.6浓缩洗涤液。5.2.7显色剂。5.2.8终止液。5.3地西泮标准工作液：取地西泮标准溶液，用稀释液稀释为浓度范围0.15μg/L～5.0μg/L。5.4洗涤液：用水10倍稀释厂商提供的浓缩洗涤液。5.5稀释液：用水10倍稀释厂商提供的浓缩稀释液。5.6酶标物溶液：在冻干粉中精确加入12mL酶标物溶解液（配制后静置至少4h或者2℃～6℃放置8h后使用），用前摇匀，酶标物溶液有效期为90d。DB34/T822—200826仪器设备6.1酶标仪（带450nm滤光片）。6.2匀浆机。6.3冷冻离心机。6.4分析天平：感量0.01g。6.5振荡器。6.6微量加样器及配套吸头：（单道20μL，50μL，100μL，多道50μL～300μL）。7测定步骤7.1样品处理取1±0.1g均质过的试样于离心管中，加9mL稀释液，4℃条件下2000g离心20min，取50μL上清液用于检测。7.2测试程序7.2.1测定在室温20℃～25℃条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20℃～25℃）下放置1h～2h。7.2.2将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。7.2.3分别在各孔中加50µL的标准品溶液或样品溶液。7.2.4在所有孔中加入100µL的酶标物溶液（推荐使用多通道加样器）。7.2.5轻轻晃动反应板，20℃～25℃反应10min。7.2.6傾出微孔中的液体，加300µL洗涤液，轻轻振荡混匀，傾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板3遍。7.2.7立即加100µL显色剂（推荐使用多通道加样器），晃动反应板使之彻底混匀，20℃～25℃避光反应10min。7.2.8每孔加100µL终止液（推荐使用多通道加样器），轻轻振荡混匀，30min内在450nm下检测吸光度。8结果判定和表述按下式计算百分吸光度值：百分吸光度值=0BB×100％…………………………………………………………（1）式中：B——为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；Bo——为零标准的标准溶液平均吸光度值；用专业计算机软件求出供试样品中地西泮的浓度，乘以稀释系数即得检测结果。或计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度（ng/L）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在150ng/L～5000ng/L范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/L）可以从校正曲线上读出。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法在动物组织中的检测限为1.5μg/kg。9.2准确度本方法在3.0μg/kg添加浓度水平上的回收率为70％～120％。9.3精密度DB34/T822—20083本方法的批内变异系数CV％≤10％，批间变异系数CV％≤15％。10其他10.1本方法动物组织稀释系数为10。10.2本方法为快速测定法，检测结果小于1.5μg/kg时可判为未检出，大于1.5μg/kg时认为可疑，需要进一步确认。10.3B0吸光值应该不低于0.8。10.4试剂盒可能存在交叉反应，不同品牌的试剂盒，其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。