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ICS67.080.20B39备案号：DB35福建省地方标准DB35/T137.5—2001古田银耳标准综合体菌种制作规程2001-08-15发布2001-09-15实施福建省质量技术监督局发布DB35/T137.5—2001I前言本部分是古田银耳标准综合体中菌种制作规程，规定了菌种制作的术语和定义、基本设备、一级种制作、二级种培养、三级种培养、病虫害防治、菌种质量要求、检验方法、标志包装保存运输。本标准由福建省质量技术监督局、福建省农业厅提出。本标准主要起草单位：古田县质量技术监督局、古田县食用菌办公室。本标准主要起草人：林祖寿、蔡金波、张国雄、彭冬祥、徐彦彦、张汉文、戴维浩。DB35/T137.5—20011古田银耳标准综合体菌种制作规程1范围本标准规定了古田银耳标准综合体菌种制作中的术语和定义、基本设备、一级种制作、二级种培养、三级种培养、病虫害防治、菌种质量要求、检验方法、标志包装保存运输。本规程适用于古田银耳菌种制作。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1耳片银耳子实体的瓣片。2.2耳基银耳子实体基部，呈桔黄色或垩白色、硬实、蒂状与培养基质相联结的部分。2.3交合将培养成熟的银耳纯菌丝与香灰菌丝按一定比例混合，培育有生产价值的银耳菌种的方法。2.4基质块在银耳子实体的耳基正下方,由以银耳纯菌丝为主和少量香灰菌丝、培养基扭结而成的硬块层。2.5基内分离在生长子实体的培养基内分离出菌种的专门技术。2.6分泌液银耳菌种正常的生理活动产生的无色、清黄或清红色的分泌液。2.7吐黑水银耳菌种被病原菌污染，或培养条件不适宜出现的异常现象。2.8“杨梅霜病”（俗名）菌种受为害时，局部表面出现白色粉斑，周围白毛团生长受抑制或逐渐消溶。2.9“死菌”菌种受为害时，前期香灰菌丝可生长，中期香灰菌丝稀疏，菌丝前端出现粉红色或褐色，后期香灰菌丝停止生长。3基本设备3.1原料仓库面积等于或大于20m2，建在制种厂的西北向，要求干燥、通风、环境卫生、远离畜、禽舍。3.2洗涤室面积等于或大于10m2，水泥地面，平整，有水源。室内配备：台秤，工业天平，50、100、500ml量杯，铁铲，水桶，铝锅，电炉，煤气炉，小压板，瓶刷，试管筐，试管（18×180mm），玻璃漏斗，漏斗架，纱布，棉塞，750ml菌种瓶。3.3灭菌室要求水泥地面，有水源。室内配备：手提高压蒸汽灭菌锅，卧式高压蒸汽灭菌锅。3.4菌种培养室DB35/T137.5—20012菌种培养室应设2间。每间面积等于或大于15m2，要求干净、通风、保温，水泥地面，平整。室内配备：加温设备、加湿设备、空调机、多层菌种架、温湿度计、吸尘器、恒温箱。4一级种制作4.1培养基制作4.1.1琼脂培养基制作采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），即去皮马铃薯200g、琼脂18g～20g、葡萄糖20g、水1000ml；pH自然。按常规方法，将培养基配制，装入试管，灭菌制成试管斜面培养基。4.1.2木屑培养基制作木屑培养基配方：银耳适生木屑71%、麸皮25%、蔗糖2%、石膏粉1.5%、硫酸镁0.2%、磷酸二氢钾0.3%；料水比，高温季节1:1.3，低温季节1:1.2。按常规方法，将培养基拌匀，装瓶（瓶内装料7cm～8cm高），灭菌制成木屑培养基。培养基的pH6～6.5，培养基的酸碱度不合要求，可按常规方法进行调整。4.2一级种制作4.2.1纯分离再交合法4.2.1.1银耳纯菌丝分离4.2.1.1.1材料选择子实体生长28d左右，朵大7cm～8cm，朵型圆正，生长健壮，耳片白且厚，无病害的银耳菌袋。4.2.1.1.2取基质块切去银耳子实体，挖出耳基正下方基质块，并切成2cm×2cm×2cm的方块做分离材料。4.2.1.1.3基质块脱水将基质块用纱布包好，置于底层放有变色硅胶或五氧化二磷干燥剂的玻璃干燥器中强行脱水10～20d，或置于阴凉通风处30d左右风干。4.2.1.1.4分离培养在无菌箱内，把基质块切开，在基质块的中、上层，钩取1mm3的白色菌丝（含基质），接种在琼脂培养基上，每支试管接1至3粒。用同样方法接20支～30支试管，在24℃的室温中培养8d～10d。4.2.1.1.5提纯转管选取生长健壮，圆正，丰满的白毛团，用接种针在白毛团边缘挑取1.5mm3带培养基的银耳纯白菌丝，移接到已灭菌新的PDA试管斜面上，置于20℃～24℃下培养10d左右。4.2.2香灰菌丝分离4.2.2.1材料选择子实体生长28d左右，朵大7cm～8cm，朵型圆正，香灰菌丝生长有力，培养料表面黑色素分布均匀，无病虫害的菌袋。4.2.2.2从银耳菌袋底部直接钩取香灰菌丝0.5mm3，置于PDA试管斜面上培养。用同样方法接20支～30支试管斜面，培养温度24℃～26℃。4.2.2.3提纯转管培养5～6d左右，取香灰菌丝尖端部位约0.5mm3（含琼脂培养），移接到已灭菌的PDA试管斜面上。用同样方法接20～30支试管斜面，在24℃～26℃温度下培养5d左右。4.2.2.4交合培养将培养10d左右，用接种钩从试管中取出一个生长健壮的白毛团，放在灭菌过的木屑培养基瓶中表面中央，同时钩取直径2mm3的香灰菌丝块，放在白毛团旁边。在室温22℃～24℃，湿度70%以下，培养15d，此时白毛团分泌黄色或棕红色水珠，再经5d培养，选其中白毛团胶质化快，出现原基早，并能形成银耳子实体，同时瓶壁上出现黑色花纹的为一级菌种。4.2.3混合分离法（基内分离法）DB35/T137.5—200134.2.3.1材料选择按4.2.1.1.1)的要求。4.2.3.2银耳菌袋表面消毒切去子实体留下耳基，菌袋表面用75%酒精消毒。4.2.3.3取基质块在接种箱内按无菌操作要求，用接种铲挖出耳基下方的基质块，用接种刀将基质块表面老菌丝铲除，取中下层基质块，放在灭菌过的木屑培养基菌种瓶中，用拌种铲捣碎后，再用接种匙取约1g～２g的基质块碎粒接入已灭菌过的菌种瓶内木屑培养基上面。用同样方法接30～50瓶。4.2.3.4培养置于室温22℃～24℃下培养，5～7d后，选取木屑菌种瓶料面上生长的圆正、丰满的白毛团，且香灰菌丝长势好，培养基上有黑色花纹的进行纯化移接。用接种钩挑取一个白毛团直接移入灭菌过的菌种瓶内木屑培养基上面。用同样方法移接40～50瓶，在22℃～24℃温度下继续培养25～35d。经培养后，选其中香灰菌丝长势均匀，吃料快，白毛团胶质化快、出耳早、朵型圆正、耳片伸长好、无杂菌污染的为一级菌种。该一级菌种直接提供制作三级菌种。5二级种制作5.1培养基配制采用木屑培养基，其配方和制作按4.1.2操作。5.2接种5.2.1在接种箱内，按无菌操作要求，用接种刀割去用纯分离再交合法培养的一级种瓶内的银耳子实体，用拌种铲将培养基表面的老化菌丝和“黑疤”点清除干净。5.2.2用拌种铲，将耳基下方2cm～3cm洁白的菌丝块捣碎。5.2.3用接种匙取2g～3g的菌种碎粒。接入经灭菌过的菌种瓶内木屑培养基上面，每瓶一级种扩接20～35瓶的二级种。5.3培养置22℃～24℃室温下培养10d左右，菌种碎粒出现白毛团，再培养5～10d，白毛团分泌黄色或棕红色水珠，随后白毛团呈胶质状原基，最后出现小耳基与小耳片；香灰菌丝生长健壮，分布均匀，分泌黑色素，使培养基表面出现黑色花纹和黑疤。前后经30d左右培养即成二级种。6三级种制作6.1培养基制作木屑培养基配方：银耳适生树木屑78%、麦皮20%、石膏粉2%；料与水比，高温季节1:1.3，低温季节1:1.2。按常规方法，将培养基拌匀，装瓶（瓶内装料4厘米～5厘米），灭菌制成木屑培养基。培养基pH6～6.5，pH不合要求，可按常规方法进行调整。6.2接种6.2.1在接种箱内，按无菌操作要求，用接种刀割除去用纯分离再交合法培养二级种的瓶内子实体或用混合分离法培养的一级种的瓶内子实体，再用拌种铲将培养基表面的老化菌丝和“黑疤”点清除干净。6.2.2用接种铲将耳基下方2厘米～3厘米的洁白菌丝块挖松、捣碎。6.2.3用接种匙取2克～3克左右菌种碎块，放在种瓶经灭菌过的培养基表面，每瓶用纯分离再交合法培养的二级种或用混合分离法培养的一级种可扩接40～60瓶。6.3培养置于温度22℃～24℃、相对湿度70%以下，弱光、空气清新的菌种室内培养，经5d左右，香灰菌丝生长均匀吃料3厘米左右，再将菌种室温度调到21℃～23℃继续培养5d，培养基表面出现许多白毛团，分泌少量无色水珠，瓶壁有淡黑色花纹，即成三级种。7病虫害防治DB35/T137.5—200147.1主要病虫害种类a）常见杂菌有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌（绿色木霉、链孢霉、黑霉、毛霉等）。b）潜伏性病害，如“杨梅霜病”、“死菌”。c）害螨等。7.2防治方法a）按防治病虫害常规方法，把好培养基选料、装管（瓶）、灭菌和接种时无菌操作的环节。b）选用健壮菌种。选用无污染、生长健壮的适龄一级种和二级种。c）试管口和瓶口的棉塞松紧要适中。接种时，发现棉塞潮湿要换上灭过菌的干棉塞。e)培养菌种过程中防止污染。培养室要清洁卫生，使用前进行消毒。菌种培养期间，每天进行通风换气，保持室内空气新鲜。要预防老鼠、蟑螂等为害。f)菌种室温度和湿度要调控适宜。防止高温、高湿。g)经常检查。接种后第三天开始，每天检查一次，发现有病虫害的菌种瓶，要立即拣出处理，并分析原因，采取措施克服。8菌种质量要求8.1感观质量要求8.1.1一级种木屑一级种的银耳菌丝和香灰菌丝比例适当，菌丝纯正，生活力强，白毛团圆正、色白，菌丝健壮丰满，接种15d后白毛团分泌液呈黄色或棕红色，20d后白毛团胶质化，随后出现子实体；香灰菌丝前期呈灰白色细绒状，生长健壮。10d左右长满培养基表面，20d左右长满全瓶，能分泌黑色素，使培养基变黑色、褐色或棕色，瓶壁上出现黑色花纹、无杂菌、无杂斑和无拮抗线，菌龄25～45d。8.1.2二级种银耳菌丝与香灰菌丝比例适当，白毛团丰满、色白，接种培养15d后，白毛团分泌液黄色或棕红色，随后较快出现胶质化原基、小耳基和小耳片；香灰菌丝生长健壮，灰白色，后期在耳基下方成束根状分布，分泌黑色素，使培养基变黑色、褐色，瓶壁上出现黑色花纹，无杂菌污染。菌龄15～30d。8.1.3三级种银耳菌丝与香灰菌丝比例适当，培养基表面有许多白毛团，白毛团色洁白，菌丝细短，密集，健壮，有少量白色水珠；香灰菌丝生长有力，均匀，整齐，能分泌黑色素，瓶壁上有黑色花纹。菌龄7～12d。9检验方法9.1感官检验棉塞无松动，试管、玻璃瓶无破损；无杂菌、害虫侵染；白毛团色洁白，形状圆整、丰满，分泌液清亮，无浊液；香灰菌丝生长有力，分布均匀，分泌黑色素，瓶壁上出现黑色花纹；培养基有香灰菌丝所产生的特有香味，手捏培养料有弹性。9.2显微镜检验银耳纯白菌丝纤细，粗细均匀，有锁状联合，锁状突起小而少。香灰菌丝细长，呈羽毛状分枝。9.3出耳试验9.3.1随机抽取4瓶木屑一级种，接种在按常规制作已灭菌的料袋中，每瓶一级种接种40袋，共接种160袋进行栽培试验。9.3.2试验栽培房条件，温度22℃～24℃，出耳相对湿度90%～95%，光照50LX～200LX散射光，空气清新。9.3.3记录接种块的起始萌发时间，菌丝蔓延生长速度，吃料能力，出耳速度，子实体形态，产量和质量等，最后通过综合分析评价。选出优质高产的，确定为一级种，即可供用户扩大培养二级种和三级种。DB35/T137.5—2001510标志、包装、保存、运输10.1标志一、二、三级菌种瓶（含试管）贴上标签，标明：菌种名称、编号、代数、级别、分离方法、分离年份、最后一次移植日期、生产单位名称。10.2包装一、二级菌种单管或单瓶用干净棉花包好，外面套上牛皮纸，用橡皮筋扎紧，最后装在木箱中。三级种用纸箱、编织袋、篮筐等包装。10.3银耳各级菌种保存期和保存方法生产上用的各级菌种不宜放在冰箱保存，木屑一级种、二级种培养成熟,在15℃～25℃范围内分别保存10d。三级种菌丝伸长至培养基三分之一时，在15℃～25℃范围内保存5～7d。10.4运输运输时包装箱上要写明易破损物，防止高温、淋雨，轻取轻放字样。