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ICS65.100.01B15国家质量监督检验检疫总局备案号：23294-2008广东省地方标准DB44/T513—2008绿僵菌微生物杀虫剂TheMycopesticideforMetarhiziumspp.（印刷稿）2008-05-26发布2008-09-01实施广东省技术监督局发布DBDBDBDB44444444DB44/T513—2008I目次前言...................................................................................II1范围..................................................................................12规范性引用文件........................................................................13术语和定义............................................................................14质量要求..............................................................................15检测方法..............................................................................26产品包装..............................................................................47标识..................................................................................48贮存..................................................................................4DB44/T513—2008II前言本标准由广东省林业局科技与对外合作处提出。本标准由广东省林业局归口。本标准起草单位：广东省林业科学研究院。本标准起草人：秦长生、徐金柱、廖仿炎。DB44/T513—20081绿僵菌微生物杀虫剂1范围本标准规定了绿僵菌Metarhiziumspp.生物杀虫剂产品中原菌粉及纯孢子粉的质量标准及检测方法。本标准适用于绿僵菌生物杀虫剂的生产与质量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T16150农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法NY/T1154.1-2006农药室内生物测定试验准则杀虫剂3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1原菌粉massproduction绿僵菌在固体培养基上充分产孢后的混合物。3.2纯孢子粉pureconidia从绿僵菌培养基培养混合物分离后得到的纯绿僵菌分生孢子粉。3.3含孢量（孢子/g）numberofconidia(conidia/g)每克菌剂中含孢子的数量。3.4活孢率viability能发芽孢子占计数孢子的百分率。3.5含水率moisturecontent菌粉中绝对含水量。3.6粉粒细度particlesize菌剂颗粒的大小。3.7杂菌率contaminants菌剂中其它微生物所占的百分率。3.8毒力virulence对目标害虫的侵染杀伤能力，用一定条件下的目标害虫致死中浓度表示（LC50）表示。3.9SDAY培养基SDAYculturemedium用葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸提粉10g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20分钟即制成SDAY培养基。4质量要求DB44/T513—20082表1绿僵菌产品质量指标5检测方法5.1操作环境超净工作台内进行。5.2含水率测定（烘箱法）5.2.1烘干每个样品准备3个土壤干燥杯。烘干前用记号笔标记所有的杯子和对应的盖子；把杯子和盖子分别放于预热的烘箱内，在80℃以上烘1小时以上。5.2.2冷却从烘箱内取出杯子和盖子放于干燥器冷却1.5小时～2小时。注：确保干燥器内的硅胶在80℃以上干燥3小时以上。5.2.3称量称量所对应用的杯子和盖子重量分别记W1和W2（单位：g），保留至数点后3位。注：用乳胶手套以避免称量者的手上的湿气。5.2.4取样加入有代表性的原菌粉样品或纯孢子粉至杯内，称重记为W3，每个原菌粉样品推荐取样3g左右，纯孢子粉取样2g左右。5.2.5烘样盛有样品的杯子放入烘箱内烘干，原菌粉需要在130℃下烘干至少4小时，而纯菌粉孢子在103℃下烘干17小时。5.2.6冷却烘干后取出杯子，盖上盖子，放入干燥器内冷却1.5小时～2小时，至室温。5.2.7称样记录干燥后重量记为W4；每个样品取3个样以保证数据的重复性。5.2.8含水率计算样品的含水量用以下公式计算(计算3次平均值)：含水量（%）=[(W3+W2-W4)/(W3-W1)]×1005.3活孢率测定5.3.1配制SDAY培养基在50mm培养皿倒成3mm厚的平板培养基，每个样要3个平板，备用。5.3.2接种用含0.05%的吐温-80无菌水溶液配制好分孢子悬浮液，通过梯度稀释，将浓度稀释至106孢子/ml左右；用无菌枪头吸取悬浮液200µl,均匀的涂于先前备好的平板培养基表面，每个样品做3个重复。5.3.3培养在25℃下培养24小时。剂型原菌粉纯孢子粉备注含孢量≥2（±1）×108/g≥4（±1）×1010/g：因菌株不同有差异活孢率≥90%如果贮存后≥75%含水率≤5%粉粒细度分散不结块95%纯菌粉≤74μm（95%通过200目）杂菌率0.05%毒力10天左右，常温常湿下，目标害虫LC50≤106孢子/mlDB44/T513—200835.3.4发芽率镜检在显微镜下观察放大300倍，用计数器计数萌发的和不萌发的孢子数。每次观察约300个孢子。孢子萌发的标志为孢子长出芽管。5.3.5计算活孢率采用以下公式计算：活孢率（%）=[a/（a+b）]×100其中a=已萌发的孢子数b=未萌发的孢子数计算3个平板的孢子萌发率平均值，并进行组内方差分析，确定样品的萌发率。5.4杂菌率测定5.4.1SDAY培养基平板制做制做90mmSDAY培养基平板，每个样品准备3个平板。5.4.2接种取0.1g纯菌粉或0.5g～1g原菌粉加入到10ml的0.05%的吐温80无菌水溶液瓶内，振荡使孢子分散均匀，用移液枪连续按10的倍数梯度稀释8次。在90mmSDAY培养基平板上，加入不同浓度的悬浮液200μl，用消毒的玻棒均匀涂抹于琼脂表面，每个样品做3个重复。5.4.3培养在25℃～27℃培养。5.4.4记数在1天～2天后记录平板上的细菌或酵母菌落及其它菌落数，记为N1。在3天～4天后记录绿僵菌和其它真菌的菌落，分别记为N2和N3。注：每个样品中如果菌落数大于300个，则不列入计数样品。5.4.5杂菌率计算杂菌率采用以下公式计算：杂菌率（%）=（N1+N3）/（N1+N2+N3）×100每个样重复3次，取平均值。5.5样品孢子含量测定5.5.1取样及处理称取0.1g纯孢子粉或0.5g～1g原菌粉记为W，加入100ml含0.05%的吐温-80无菌水溶液，剧烈振荡至形成均匀溶液。5.5.2孢子数量检查按10的倍数梯度稀释至每个视野内100孢子左右后，稀释倍数记为K，用血球计数器计数；上下左右中选5个格子作为计数格，总数记为N。5.5.3计算含孢量采用以下公式计算：溶液浓度L（孢子/ml）=（N/80）×4×106样品含孢量R（孢子/克）=L×K×100/W重复3次，取平均值。5.6粒细度测定参照GB/T16150农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法。5.7毒力测定参照NY/T11541-2006农药室内生物测定试验准则不同的菌株用不同的目标害虫进行测定。DB44/T513—20084测定使用浓度106～107孢子/ml。测定时间在10天左右；用死亡机率计算出菌株LC50。6产品包装原菌粉采用两层包装，用聚乙烯塑料袋为内袋，热压封口；外袋塑料纺织袋，线机封口。每袋按应用要求，重量为5kg～15kg。纯菌粉采用聚乙烯塑料袋单层包装，排除袋内空气后热压封口。每袋重量可为500g或1000g。7标识原菌粉和纯菌粉均在外包装上注明“绿僵菌原（纯）菌粉、含孢量、防治目标害虫、应用浓度及方法、保存方法、有效期、生产日期、生产单位、联系电话、注意事项”等。8贮存原菌粉贮藏在通风、阴凉、干燥外，室温不超过25℃，贮存期限100天。纯菌粉贮藏在0℃～4℃冷藏室或冷藏箱内，贮存期限200天。